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1、唾液淀粉酶活性的观察,实验二,上节回顾,1.,实验目的及原理,2.,实验试剂及仪器,3.,实验步骤及注意事项,4.,上节回顾,A 保持微量移液器垂直，将按钮压至第一段；B 微量移液器头尖端浸入溶液，缓慢释放按钮；C 保持微量移液器垂直，将微量移液器头与容器壁接触，慢慢压下按钮至第一段；D 压至第二段把溶液完全释放出；E 释放按钮回原状,调最大量程，归位。,成绩分布,1.考勤、纪律、操作 30%2.实验报告 30%3.理论考试 40%,实验目的,本实验用唾液淀粉酶为材料来观察酶活性受各种因素影响的情况。,实验原理,酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物具有高效催化作用的生物大分子。大多数酶的化学本
2、质是蛋白质（少数为RNA）。酶的活性是指酶催化化学反应的能力，其衡量的标准是酶促反应速度。酶活性的测定，通常是在最适条件下，通过测定酶促化学反应的底物或产物量的变化来进行观察。酶的活性是受到多种因素影响的：包括温度、pH、激活剂及抑制剂等。,双重影响温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低。,最适温度(optimum temperature)：酶促反应速度最快时的环境温度。,*低温的应用,温度对酶活性的影响,pH对酶活性的影响,最适pH(optimum pH)：酶催化活性最大时的环境pH。,抑制剂对酶活性的影响,酶的抑制剂(inhibitor
3、)凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂。Cu2+为唾液淀粉酶的抑制剂。,区别于酶的变性,抑制剂对酶有一定选择性 引起变性的因素对酶没有选择性（凡能够引起蛋白质变性的因素，都可以使酶丧失活性）,激活剂对酶活性的影响,激活剂(activator)使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质。大部分是无机离子或简单的有机小分子。Cl-为唾液淀粉酶的激活剂。,酶的特异性,酶对催化的反应和反应物有严格的选择性。唾液淀粉酶将淀粉水解成的麦芽糖则具有还原性,能够使斐林试剂还原,生成砖红色的沉淀。蔗糖水解产生的葡萄糖和果糖都具有还原性,但唾液淀粉酶不能将蔗糖水解。,唾液淀粉酶检测原理,酶
4、的活性通常是以测定酶作用的底物在酶作用前后的变化来进行观察。本实验用唾液淀粉酶作用的底物-淀粉，被唾液淀粉酶水解成各种糊精、麦芽糖等产物的变化来观察该酶在各种环境下的活性。,淀粉蓝色糊精紫色糊精红色糊精无色糊精麦芽糖 葡萄糖 蓝色 蓝色 紫色 红色 无色 无色,碘与淀粉及其水解产物的呈色反应：,唾液淀粉酶检测原理,本实验中唾液淀粉酶的最适温度是37、最适pH值是6.8、激活剂是0.5%的NaCl溶液、抑制剂是1%CuSO4溶液。注意：唾液淀粉酶的最适pH约为6.8，最适pH受缓冲液性质的影响，在磷酸缓冲液中最适pH为6.4-6.6，在醋酸缓冲液中则为5.6。,试 剂,1,2,3,4,不同pH溶
5、液：pH5.0缓冲液pH6.6缓冲液pH8.0缓冲液,0.5%蔗糖溶液,0.5%淀粉溶液,稀碘溶液,仪器,电磁炉,恒温水浴锅,实验内容,1,唾液淀粉酶应用液的制备,2,温度对酶活性的影响,3,pH对酶活性的影响,4,酶反应的特异性,5,激活剂与抑制剂对酶活性的影响,1、唾液淀粉酶应用液的制备,取三支试管（做好标记），试剂加好后混匀，然后及时在上述温度下分别进行处理。在干净的比色板上，于各孔穴中分别滴加2滴碘液。每隔1min从第2支试管中取反应液1滴，与比色板孔穴中的碘液混合，观察颜色的变化。待第2支试管中反应液与比色板孔穴中的碘液混合颜色不再变化时，取出试管，并将在沸水浴中处理的试管用冷水冷却
6、，然后向各试管中滴加碘液13滴。摇匀后观察并记录各管颜色，比较各管中淀粉水解的程度，说明温度对酶活性的影响。,2、温度对酶活性的影响,3、pH对酶活性的影响,取三支试管做好标记，先向各管中加淀粉溶液和缓冲液，最后加稀释唾液，摇匀后，将各管置于37水浴中处理。每隔1min从第2支试管中取反应液1滴，与比色板孔穴中的碘液混合，观察颜色的变化。待第2支试管中反应液与比色板孔穴中的碘液混合颜色不再变化时，取出试管，向各试管中滴加碘液13滴。观察各管颜色，比较各管中淀粉水解的程度，解释pH对酶活性的影响。取用不同试剂时，应及时冲洗吸管，以防造成污染。,4、酶反应的特异性,取两支试管，加入相应试剂，摇匀后
7、，将各管置于37水浴中处理10min。取出试管，分别加入斑氏试剂2ml，混匀。将各管置于沸水浴中煮沸1-2min。观察并解释结果。,5、激活剂与抑制剂对酶活性的影响,取三支试管，加入相应试剂，将各管混匀后，一起放入37水浴中保温。每隔30秒，从第2支试管中取出1滴反应液滴于白瓷板上，随后滴加稀碘液1滴于此滴反应液中，观察其颜色变化。待加碘不变色（或颜色变化很浅时）时，取出3支试管，分别加入稀碘液13滴。观察、比较各管颜色的深浅，并解释。,1.洗涤仪器用蒸馏水（因自来水含Cl-）。2.试管做好标记。3.试剂要混匀。4.观察要及时。5.不要吸取斑氏试剂沉淀。6.各人唾液淀粉酶活力不同，如按上法制得
8、 的唾液消化太快或太慢，可稀释唾液或向反应系统中多加一些唾液。7.试剂量少，不需润洗。,注意事项,环境的pH显著影响酶活性，pH既影响酶蛋白本身也影响底物的离解程度，从而改变酶与底物的结合和催化活性。在某一pH时，酶活性达最大值，这一pH称酶的最适pH。不同的酶，最适pH不尽相同。淀粉酶该酶最适pH为pH6.9，高于或低于酶的最适pH值，都将引起酶活性的降低，过酸或过碱的反应条件可使酶活性丧失。判断pH对酶活性的影响，可用不同PH值条件下淀粉水解的快慢来衡量酶活性的高低，淀粉的水解程度可用与碘的呈色反应来判断。,温度升高，酶促反应速度加快，当上升至某一温度时，酶促反应速度达最大值，此温度称为酶的最适温度。人体内大多数酶的最适温度在37左右。由于酶的化学本质是蛋白质，温度过高会导致蛋白质构象的改变，温度愈高，酶蛋白变性愈严重，到80时，大多数酶的活性几乎完全丧失。如果温度继续升高，反应速度反而会迅速下降。,
