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1、实验一 微生物染色,实验目的染色原理染色方法实验材料实验内容与步骤注意事项实验结果,一、实验目的 学习微生物的染色原理、染色的基本操作技术，从而掌握微生物的一般染色法和革兰氏染色法。,二、染色原理 由于微生物细胞含有大量水分，对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大,机体是无色透明的，与周围背景没有明显的反差,在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成。所以，微生物细胞表现出两性电解质的性质。两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性带正电。在碱性溶
2、液中离解出酸性基呈酸性带负电。经测定，细菌等电点pH在2-5之间，故在中性、碱性或偏酸性溶液中，细菌的等电点均低于上述溶液的pH值，所以细菌带负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的较多。微生物体内各结构与染料结合力不同，故可用各种染料分别染微生物的各结构以便观察。,三、染色方法(一)简单染色法 简单染色法又叫作普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色，如果仅为了在显微镜下看清细菌的形态，用简单染色即可。,(二)复染色法 用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。革兰氏染色法：不仅能观察到细菌的形态，而且
3、还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。,四、实验材料1.显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯等。2.石炭酸复红染液、草酸铵结晶紫染液、碘液、95乙醇、蕃红染液3.菌种：金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌,五、实验内容与步骤(一)细菌的简单染色步骤 涂片干燥固定染色水洗干燥镜检1涂片 取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种(金黄色葡萄球
4、菌或枯草杆菌)与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。2干燥 涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。,3固定 固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过23次，共约23秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60）,放置待冷后，进行染色。4染色 在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸复红、草酸铵结晶紫或美蓝任选一种)一滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。5水洗 斜置载玻片，在自
5、来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。6干燥 用吸水纸吸去涂片边缘的水珠，置于室温下自然干燥。用吸水纸时切勿将菌体擦掉。,7镜检 用显微镜观察，并用铅笔绘出细菌形态图。(二)细菌的革兰氏染色步骤 涂片干燥固定初染水洗媒染水洗脱色水洗复染水洗干燥观察1取大肠杆菌和枯草杆菌(均以无菌操作)分别做涂片、干燥、固定，方法均与简单染色的相同。2用草酸铵结晶紫染色1min后水洗。3加碘液媒染1min后水洗。4斜置载玻片，滴加95乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色 为止，大约需时2030s，随即水洗。,5用蕃红染液复染1min，水洗。6用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的
6、物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。绘出细菌的形态图并说明革兰氏染色的结果。,六、注意事项,1革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。因此必须 严格把握脱色时间。,2 选用培养18-24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。,思考题及实验作业1 不经复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和阴性菌？2 通过革兰氏染色，你认为它在微生物学中有何实践意义？,七、实验结果简单染色：金黄色葡萄球菌和枯草杆菌染成（）色。革兰氏染色（大肠杆菌与枯草杆菌）：将结果填于下表中,
