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1、实验二 性染色质观察,一、实验目的：,三、实验材料：,四、操作步骤：,五、结果分析：,二、实验原理：,一、实验目的：,通过实验初步掌握观察与鉴别X-染色质的简易方法，识别其形态特征及所在部位，为进一步研究人体染色体的畸变与疾病，提供参考条件。,简述用以说明性染色质而制备人体口腔粘膜鳞状上皮细胞装片的步骤。,说明人体细胞核中X染色体数目和性染色质体数目的关系。,二、实验原理：,巴尔和伯特伦（1949）注意到一个深着色小体，并且不是和核仁就是跟核膜接近，绝大部分存在于雌猫的神经细胞和中，这种小体几乎不会出现在雄猫类似的细胞中。进一步研究表明性的二态现象出现在像有袋动物，偶蹄目动物，翼手目，食肉动物
2、和灵长目这些有代表性的动物的大多数细胞中。然而，一些兔形动物，性别差异只在很少一些组织中观察得到。,这个染色质体，是雌性细胞区别于雄性细胞的标志。现在它通常叫做性染色质或叫做巴尔氏小体。除神经细胞外的其他细胞中的巴氏小体（直径为1m）具有典型的平凸的外形，靠近于核膜内侧处。细胞化学上看，性染色质的福尔根反应阳性并具有用甲基绿派若宁染色很深，表示有DNA的存在。,相当多的证据已经证明性染色质是没有活性的X染色体。正常的男性，只有一个X染色体，没有性染色质（见图2.1 上）。正常女性，拥有2个X染色体，每个细胞核有一个染色质小体（图2.1下），但是一个雌性三倍体的X染色体有两个性染色质体（图2.2
3、）。几乎没有雌性的动物的4个X染色体的每个核内有3个巴氏小体。,二、实验原理：,Barr小体数=细胞内X染色体数 1,Barr小体特征及位置：它是处于失活状态的X染色体，一般位于细胞核膜内侧边缘的一个深染区（较细胞核要小），形状多样。,图2.1,图2.2,二、实验原理：,由于两个X染色体中的一个失活(小资料：三色猫)，性染色质小体可以在间期细胞核中见到。这些活包括特殊X染色体的异质化。利用放射性标记技术，Morishima 等（1962）发现了无活性的X染色体，像其他的异质染色体，他们在细胞核中较其他染色体晚些复制。另外，这些晚复制X特点是位于核的边缘，性染色质小体大多在这里被观察到。总的来说
4、，所有的细胞都包含着一个X染色体。带有遗传上具有活性的染色质叫做常染色质，所有额外的X染色体成为异染色质的性染色质体。,证明人的口腔粘膜鳞状上皮细胞存在性染色质的方法是Ludwing和Klinger（1958）发明的，本实验使用1960年经Reynolds修改的方法。,二、实验原理：,三色猫,三毛猫，又称三色猫，指黑色、橘色与白色参杂在身上的猫，亦称为玳瑁色。,成因：因决定黑色和橘色的基因是位于X染色体上(白色基因在体染色体上)，若是猫的基因在分化的时候随机去活性化，可能毛色细胞内黑色基因被去活性而表现出橘色，反之则呈现黑色，因此绝大部分三毛猫都是雌性。在少数的例子里，因多出一个X染色体(en
5、:Klinefelters syndrome)或嵌合体的情况会出现三色公猫。在日本因为雄性三色猫的稀少的缘故，而被视为一种幸运的象征。,二、实验原理：,三毛猫组图,三毛猫,三毛猫,三色公猫（上）土耳其三色猫（左）,三、实验材料：,带有油镜的显微镜,压舌板,1%水溶性硫槿染液,酒精（浓度：50%，70%，95%，100%）,二甲苯,5或6当量（N）盐酸（HCl）于滴瓶中,香柏油,载玻片,盖玻片,广口瓶或平皿,镊子,四、操作步骤：,1.毛发根部细胞的观察:,拔取一根带有毛根的头发，自基部截取20m左右置载玻片上，小心剔下毛囊细胞(注意千万不要触及毛发干),拔去毛发干,将细胞团块散开,加一滴改良酚红
6、染液，覆以盖片，在酒精灯上轻微加热后，静置15分钟，隔一片吸水纸用手指轻度加压后镜检。,四、操作步骤：,2.口腔粘膜细胞观察:,要想制备一个适合的口腔粘膜涂片将会遇到两个问题。如果你的装片不是绝对的干净，在染色的环节你将会失去上皮细胞。所以，玻片必须用去垢剂洗，而且在流水中冲洗，然后最终用70%的酒精冲洗，用火烤干他们。第二个问题较难克服，就是上皮细胞能被口腔细菌所污染。细菌特别麻烦，因为他们容易被硫槿溶液染色并且和性染色质混淆。如果碰巧他们会遮盖在上皮细胞核上面，因此，细胞提供者需要严格地用水龙头的水漱口，以便去掉松动的上皮细胞和细菌。这样的漱口应该重复两三次才能达到最好效果。,方案1:,用
7、清洁灭菌的载片或适当的刮片，从女性口腔两侧颊部刮取上皮粘膜细胞，在原位刮取2-3次，分别涂抹在干净载片上，每次可涂1-3片，涂抹范围约1-2张盖片大小。待稍干后，滴加1-2滴改良酚红，在室温下染色1-5分钟，勿使干燥，然后再加盖片复以吸水纸，用手指轻度加压后进行镜检。,涂片后如不立即检查，应在稍干时立即放入95%酒精中固定30分钟以上（也可达1-2天），取出干后编号，放置冰箱内保存。,四、操作步骤：,2.口腔粘膜细胞观察:,方案2:,用清洁灭菌的载片或适当的刮片，从女性口腔两侧颊部刮取上皮粘膜细胞，在原位刮取2-3次，分别涂抹在干净载片上，每次可涂1-3片，涂抹范围约1-2张盖片大小。待稍干后
8、，用95%乙醇浸泡每片玻片2分钟，然后用70%乙醇泡2分钟，然后是50%乙醇2分钟，最后用蒸馏水洗2分钟。从蒸馏水中拿出玻片后，滴几滴5或6NHcl在细胞上静置5秒钟。这是准备染色的十分关键的一步。酸水解细胞核中的RNA并因此消灭了富RNA小体，这些小体也可被硫槿染液染色。过度的水解会破坏RNA也会破坏富DNA的性染色质体，然而水解不足会留下象核仁那样完整的富RNA小体。,四、操作步骤：,2.口腔粘膜细胞观察:,硫槿染液对核酸是特异性的，能将DNA染成深蓝黑色，而将RNA染为紫色。然而当研究细胞中核仁及性染色质这样小的物体时，最好避免按照颜色的不同来区分他们。适当的水解将会消除富RNA小体并防
9、止与富DNA性染色质小体的混淆。,接下来，把玻片放到蒸馏水中1015秒钟以去掉Hcl。然后用1%硫槿染液染色1015分钟，之后用蒸馏水洗,再按照下面步骤脱水：50%乙醇 30秒，70%乙醇 30秒，95%乙醇 30秒，纯乙醇 30秒。,现在，把玻片放到二甲苯中分色1分钟。拿出玻片后，立即滴上一滴香柏油并且盖上洁净的盖玻片。在放盖玻片时要小心不要留有气泡。,这样制备的粘膜细胞可以识别无色的细胞质和一个浅兰色的核。用低倍镜对细胞进行观察；然后用油镜对性染色质进行检测。,3.性染色质和核的性别,四、操作步骤：,类似性染色质的染色质体，偶尔在雄性组织中观察到。在雄性细胞中发现的类似性染色质的统计发生率
10、通常的范围是从口腔粘膜细胞的2%到肝脏制片高达20%。实际上，对核的性别的精确确定，统计学上有意义的细胞数字必须来检测只有性染色质的细胞百分数。对于雌性口腔粘液细胞，大多数的实验者发现50%到60%健康细胞存在着性染色质。只有外形正常且染色均匀的才算数。核折叠,有粒状的核质，或者证明有任何衰退迹象的细胞都不能包括在这个关键的实验中。,五、结果分析：,X染色质的辨认,低倍镜下检出典型的可数细胞：,标准：A、核质呈网状或细颗粒状分布；B、核膜清晰，核无缺损；C、染色适度；D、周围无杂菌；,高倍镜下观察：1、核膜内侧边缘；2、核仁附近；3、染色质中间游离部位。（正常女性口腔粘膜细胞中约30-50%有
11、一个Barr小体。在不同实验室中计数的差别较大，而在男性中则仅只偶尔可见不典型者这是环境引起代谢的暂时现象，约2%以下）,五、结果分析：,1.检测50个取自女性的口腔粘膜鳞状上皮细胞,有多少个存在性染色质？这50个细胞中有性染色质的百分比是多少？,2.50个取自男性的口腔粘膜细胞中有性染色质的发生率是多少？,3.你发现女性细胞中多一个性染色质小体的情况吗？,4.对于大多数哺乳动物的研究，特别是人类，搜集的证据表明Y染色体决定为雄性，除有少数例外，个体表型将会是雄性。决定雌性的基因显然座落在X染色体和常染色体上；人类正常女性的体细胞有46条染色体,包括44条常染色体和2条X染色体;正常男性有44条常染色体加上一个X和一个Y染色体。根据这些信息完成表2.1，指出个体可能存在的完全性染色体数及个体体细胞中所有的染色体总数。（假定正常的常染色体是44条）,五、结果分析：,a.表2.1中所描述的哪个个体有经典的唐纳氏综合症?,b.哪个个体是经典的Klinefelter综合症?,c.哪些个体可能被认为是中性？,结束,
