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1、实验六 碱法提取质粒,转到目录,目 录 返回标题,一目的二原理附：原理示意图三试剂四器材五注意事项 六操作步骤 1 六操作步骤 2 六操作步骤 3,GFPuv质粒的信息图片GFPuv vectors DescriptionLocation of features 1Location of features 2Location of features 3Location of features 4Vectors Primer LocationPropagation in E.coli,一目的,了解提取质粒的原理。学习和掌握质粒提取的方法和技术。三个基本步骤：细菌的生长和质粒的扩增菌体的收集裂解及
2、质粒DNA的分离质粒DNA的纯化返回目录返回目录,二原理,质粒是细菌内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型。质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介，这种基因的运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基体的实验技术。质粒的提取是利用质粒DNA与染色体DNA分子大小不同和性质的差异性进行的。染色体DNA比质粒DNA大得多，且是线状分子易断，经加热或碱处理后容易变性并产生沉淀，即使冷却或碱性被中和后也不可能复性，与变性蛋白质及细胞碎片一起沉淀析出。质粒DNA是共价结合的环状分子，不会因加热或碱处理等被折开，加热冷却或恢复中性PH后
3、又呈天然构型，溶解在溶液中。这样通过加热或碱处理后又中和PH，再用离心的方法就可把质粒DNA提取出来。原理示意图返回目录,原理示意图 返回目录 返回原理,三试剂,1.LB培养基 detail2.STE detail 3.溶液 I detail4.溶液 detail5.溶液III detail6.3M乙酸钠(pH5.2)detail7.TE(pH8.0)detail 返回目录,LB培养基 back,配制1升培养基，应在950ml去离子水中加入：细菌培养基用胰化蛋白胨(bacto-tryptone)10g细菌培养基用酵母提取物(bacto-yeast extract)5gNaCl10g摇动容器直至
4、溶质完全溶解，5mol/L NaOH(约0.2ml)调节pH值至7.0,加入去离子水至总体积为1L，15 lbf/in2(1.034105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。,STE back,0.1mol/L NaCl10mmol/L TrisCl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)在15 lbf/in2(1.034105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。,溶液 I back,50 mmol/L 葡萄糖25 mmol/L TrisCl(pH8.0)10 mmol/L EDTA(pH8.0)在10 lbf/in2(6.895104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，保存于4。,溶液 II ba
5、ck,0.2 mol/L NaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释)1%SDS,溶液 III back,5mol/L 乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml所配成的溶液重钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。,3M乙酸钠(pH5.2）back,在800ml水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至5.2，加水定容到1L，分装后高压灭菌。,0.5 mol/L EDTA(pH8.0),在800ml 水中加入 186.1g EDTA-Na2H2O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0(约20g NaOH颗粒)，然后定容至1 L，分装后高压灭菌。,
6、1 mol/L TrisCl(pH8.0),在800ml 水中加入 121.1g Tris-base，溶解后加浓盐酸调节溶液的pH值至8.0，定容至1 L，分装后高压灭菌。,TE(pH8.0)back,10 mmol/L TrisCl(pH8.0)1 mmol/L EDTA(pH8.0),50TAE,242g Tris 碱57.1 冰乙酸100ml 0.5mol/L EDTA(pH 8.0),1TAE,0.04 mol/L Tris-乙酸0.001 mol/L EDTA(pH 8.0),四器材,1.恒温摇床2.超净工作台3.离心机4.电泳仪和电泳槽5.玻璃器皿与耗材 量筒、三角瓶、平皿;EP管
7、(1.5ml,0.5ml);枪头(1ml,0.2ml,10l);牛皮纸、纱布、牙签等返回目录,五操作步骤 1,挑选一个单菌落，接种到含适当抗生素的3ml LB培养液中，37振荡培养1416小时。取1.2 ml菌液，12,000rpm离心1分钟，收集菌体。加入500l1ml STE buffer，涡旋打匀，12,000rpm离心1分钟，收集菌体。加入预冷的溶液I 100l，涡旋振荡充分悬浮，分散，混匀，冰浴5分钟(重悬细胞)。加入200l溶液(现配)，快速轻柔颠倒几次，直至溶液澄清，保持冰浴(碱变性染色体DNA、蛋白质)。在5分钟内，加入溶液III 150l，轻柔颠倒510次，冰浴10分钟（利用
8、pH差异，复性质粒DNA）返回目录,五操作步骤 2,12,000rpm离心10分钟，沉淀染色体DNA，及不溶的变性蛋白，取上清。上清液用Tris-HCl饱和苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提1-2次，每次剧烈振荡20秒，12,000rpm 离心5分钟，可见溶液分三层，上层为质粒DNA溶液，中层为蛋白层，下层为酚层。上清液用氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，12,000rpm离心10分钟。上清液加入1/10体积 3M NaAc，2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置10-15分钟。在12,000rpm离心10分钟得到质粒DNA沉淀。返回目录,五操作步骤 3,去上清，加入1ml 75%乙醇，洗涤
9、沉淀。12,000rpm 离心10分钟。去上清，吸出痕量剩余乙醇，风干。加入3050l ddH2O或TE（pH 8.0），溶解质粒。加入RNaseA使终浓度为20g/ml，室温放置30分钟1小时。1%琼脂糖凝胶电泳检测所提质粒DNA纯度及浓度。取1-5l DNA样品，加水稀释至1ml，混匀后转入 分光光度计的石英比色杯中，测定 OD260及OD280，并计算OD260/OD280比值和DNA浓度：DNA浓度=OD260稀释倍数50/1000（g/l）返回目录,分次收集4ml菌液离心，留沉淀,五操作步骤 4,琼脂糖（1%）凝胶电泳称取一定量琼脂糖凝胶，按1g中100ml的量加入1TAE，微波炉中
10、加热约2min，使琼脂糖溶解；溶液冷至60，加入 EB至终浓度为0.5g/ml，混匀，注意戴手套操作；将琼脂糖倒入电泳板中，使凝胶厚度约为cm，迅速插上梳子，检查有无气泡；待凝胶完全凝固后（约30min），小心取出梳子，将凝胶板置于电泳槽中，加入1TAE电泳buffer，让液面高出胶面1mm；在DNA样品中加入1/6 loading buffer，混匀后用移液枪将样品加入样品孔中电泳，电压降选择为1-5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）；根据指示剂的位置，判断是否终止电泳。返回目录,pGFP pBSK M,六注意事项,为提高质粒产量，要注意下面两个步骤：加入溶液I 后，涡旋振荡应充分打散
11、菌体使之均匀悬浮；加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒510次)，使蛋白质和核酸变性；加溶液III后PH要达到中性(轻柔振荡510次)，使质粒DNA复性，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分开，否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。返回目录,周四：熟悉实验原理及步骤，清洗三角瓶、量筒等器皿，装枪头，1.5/0.5 ml离心管，装牙签及配溶液等 50TAE:500 ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0):500 ml 1mol/L Tris.Cl(pH8.0):500 ml 0.1mol/L CaCl2:500 ml ddH2O:每组100 ml 5 mol/L NaOH:10
12、0 ml 配LB培养基 液体：全班1000 ml150 ml4 瓶（Amp+）(终浓度为60g/ml)，用于两个质粒的接种100 ml 4瓶(Amp-)，留做感受态细胞 固体（含1.5%琼脂粉）：每组100 ml，共1500ml，可一起配再分装每组倒5个平板（Amp+），用于次周转化灭菌。,七实验安排,周五：用Kit 提取质粒DNA，倒琼脂糖凝胶板（1%），进行琼脂糖凝胶电泳和浓度测定每人分别提取pGFPuv、pBSK质粒 各一管，每管60l取1-2l电泳，1-5l用dd H2O稀释后 在紫外分光光度计下测 OD260及OD280，并计算浓度对质粒酶切过夜周六：酶切样品琼脂糖凝胶（1%）电泳用
13、Kit对酶切后的DNA（pBSK 大片段和GFP基因片段）片段进行胶回收每组用一个柱子回收电泳检测胶回收情况，用紫外检测回收 DNA的浓度后，存放于-20冰箱中,七实验安排-续,GFPuv质粒的信息图片,返回目录,GFPuv vectors Description,pGFPuv carries the“cycle 3”variant of GFP described by Crameri et al.(1).This gene was cloned between the two MCSs of the pUC19 derivative pPD16.43(2).The GFPuv gene c
14、an be easily excised from pGFPuv.Alternatively,the GFPuv coding sequence can be amplified by PCR.The GFPuv gene was inserted in frame with the lacZ initiation codon from pUC19 so that a b-galactosidase-GFPuv fusion protein is expressed from the lac promoter in E.coli.Note,however,that if you excise
15、the GFPuv coding sequence using a restriction site in the 5 MCS,the resulting fragment will encode the native(i.e.,non-fusion)GFPuv protein.The pUC backbone of pGFPuv provides a high copy number origin of replication and ampicillin resistance gene for propagation in E.coli.返回目录,GFPuv vectors Locatio
16、n of features 1,lac promoter:95178 CAP binding site:111124 35 region:143148;10 region:167172 Transcription start point:179 lac operator:179199 lacZ-GFPuv fusion protein expressed in E.coli Ribosome binding site:206209 Start codon(ATG):217219;Stop codon:10031005 5 MCS:234281返回目录,GFPuv vectors Locatio
17、n of features 2,GFPuv gene Start codon(ATG):289291;Stop codon:10031005 GFP chromophore:481489 wt GFP cDNA sequences(3):289454 Synthetic GFP gene with cycle 3 mutations from pBAD-GFPuv(1):4551007 Cycle 3 mutation F99S(TC):584 Cycle 3 mutation M153T(TC):7Cycle 3 Cycle 3 mutation V163A(TC):776 Cycle 3
18、silent mutation in L137(TC):699 Cycle 3 silent mutation in T225(AT):963 Q80R mutation(AG)(4):527返回目录,GFPuv vectors Location of features 3,GFPuv gene Arg codons optimized for E.coli:R73(AgACgT):505507,R96(AgACgC):574576,R12(AgACgT):652654,R168(AgACgC):790792,R1215(AgACgT):931933 Silent mutations(CccA
19、TccG)creating BspE I site:510&513 Silent mutation(AG)creating Mlu I site:612 Silent mutations(TtGgaACtCgaG)creating Xho I site:709,711&714 Silent mutations(AGTC)creating BamH I site:811812 Silent mutation(CG)creating Sal I site:894 Silent mutations(ActAGctC)creating Sac I site:993&996 Silent mutatio
20、n in S72(AC):504 返回目录,GFPuv vectors Location of features 4,3 MCS:1071091 Ampicilin resistance gene Promoter:35 region:14671472;10 region:14901495 Transcription start point:1502 Ribosome binding site:15251529 b-lactamase coding sequences:Start codon(ATG):15371539;Stop codon:23952397 b-lactamase signa
21、l peptide:15371605 b-lactamase mature protein:16062394 pUC plasmid replication origin:25453188返回目录,GFPuv vectors Primer Location,GFP-N Sequencing Primer(#6476-1):331352(Note:The GFP-C Sequencing Primer cannot be used with pGFPuv.)返回目录,Propagation in E.coli,Recommended host strain:JM109 or DH5aSelectable marker:plasmid confers resistance to ampicillin(100 mg/ml)on E.coli hosts.E.coli replication origin:pUCCopy number:500Plasmid incompatibility group:pMB1/ColE1返回目录,
