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1、实验十一 DNA凝胶回收,一、实验原理,通过一定的方法将琼脂糖凝胶上需要的目的DNA带回收下来，用于下游实验。,琼脂糖凝胶电泳片断回收的常用方法,1.柱回收试剂盒,是目前最简单快速的回收方法，只需要将电泳凝胶中的产物条带切下，用溶解Buffer彻底溶解，上包埋有纯化填料的纯化柱，离心，再洗涤一次，离心后用洗脱缓冲液洗脱。全程不过10多分钟，得到的产物溶液可以直接用于后继实验。这个方法几乎不需要什么技巧就能得到稳定的结果，也是目前最多商品化试剂盒选择的方法。但是这个方法不适合用于大片断的回收。,2.低熔点琼脂糖 传统手工操作方法之一，低熔点琼脂糖制备凝胶，电泳后切割目的条带，在TE溶液中65度保
2、温融化，用传统的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。这个方法现在用的人已经不多了。以前经费紧张，低熔点琼脂糖贵，比较经济方法就是常规琼脂糖电泳后，在目的条带前方挖槽，灌入低熔点琼脂糖，凝胶后再电泳一小会儿，等条带进入低熔点琼脂糖区域再切出来，这样就非常节约了。,二、实验目的,1.从含有目的基因片段凝胶块上回收DNA。2.回收目的基因片段为下步连接反应作准备,仪器及耗材：天平、台式离心机、微量移液器及吸头、EP管。材 料：含有目的基因酶切产物的凝胶块试 剂：AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒；无水乙醇；,三、实验仪器、材料和试剂,四、实验步骤,1.在紫外灯下切下含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝
3、胶表面液体并切碎。计算凝胶重量（提前记录 1.5 ml 离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如 100 mg=100 l 体积）。2.加入 3倍凝胶体积的 Buffer DE-A，混合均匀后于 75C加热（低熔点琼脂糖凝胶于 40C加热），间断混合（每 2-3 min），直至凝胶块完全熔化（约 6-8 min）。*Buffer DE-A为红色溶液。在熔化凝胶的过程中，可以帮助观察凝胶是否完全熔化。3.加 0.5倍Buffer DE-A 体积的 Buffer DE-B，混合均匀。当分离的 DNA 片段小于 400bp 时，需再加入 1个凝胶体积的异丙醇。加Buffer DE-B后混合物颜色变为
4、黄色，充分混匀以保证形成均一的黄色溶液。,4.吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2 ml（试剂盒内提供）离心管）中，12,000g离心 1 min。弃滤液。5.将制备管置回2 ml离心管，加500 l Buffer W1，12,000g 离心30 s，弃滤液。6.将制备管置回2 ml离心管，加700 l Buffer W2，12,000g离心30 s，弃滤液。以同样的方法再用 700 l Buffer W2洗涤一次 12,000g离心1 min。确认在Buffer W2 concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。两次使用Buffer W2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对后续实验的影响。7.将制备管置回 2 ml离心管中，12,000g离心 1 min。8.将制备管置于洁净的 1.5 ml 离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加 25-30 l Eluent 或去离子水，室温静置 1 min。12,000g离心 1 min 洗脱 DNA。*将Eluent或去离子水加热至65将提高洗脱效率,
