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1、实验十二 血清肌酸激酶测定与应用,1 实验目的,了解血清肌酸磷酸激酶测定的方法。掌握其测定的应用与意义。,2 实验原理,肌酸激酶（Creatine phosphokinase，简称CK）广泛存在于骨骼肌、心肌和脑组织中，肝脏和红细胞等不含此酶。骨骼肌中含量最丰富，占全身总量的96%之多。肌酸磷酸激酶在肌肉收缩中很重要，它催化下列反应：,上述反应保证肌肉收缩时的能量供应和运动后ATP和肌酸磷酸的再合成。正常人血清中肌酸磷酸激酶主要由骨骼肌和心肌细胞透过细胞膜进入血液的结果，其活力很小。正常值每升血液中100活力单位以下。运动训练能使血清肌酸酸磷酸活性升高。其原因一般认为运动时缺氧,代谢产物积累，
2、供能相对不足等原因，引起肌细胞膜通透性升高。或肌细胞膜受到损伤，促使CK从细胞内释放增加，进入血液循环，其中以肌肉牵拉的机械性损伤或产生血肿等原因最为重要。,滑雪运动和马拉松赛跑后，血清CK的活性较高，特别是大强度的马拉松赛跑最高。在运动后4小时升高，8-16小时达最高值。跳跃、短跑等短时间激烈运动，冲击性运动，也易引起CK活性升高。大运动量的训练和100m、200m跑比赛后，血清中CK活性都显著升高，尤其是在比赛时，升高更为显著。应用肌酸磷酸激酶来作机能评定时，一般认为2-3天取血测定一次,在负荷后经常处于100-200国际活力单位/L。如果超过200IU/L，就是运动量过大，身体尚未恢复，
3、此时应调整运动量。,3 实验器材与试剂 器材,器材 试管、分光光度计、分析天平、采血装置（注射器）、水浴箱、离心机,试剂,试剂 混合底物pH 7.4 三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）2.4g，加蒸馏水至100 ml，再加入0.2 N盐酸88.8 ml及无水硫酸镁0.34g，调节pH至7.4。此液在室温下可保存数月。0.012 M磷酸肌酸溶液：称取磷酸肌酸钠（C4H8O5-O4PNa36H2O）436 mg，加蒸馏水至100 ml，调节PH至7.4，保存于-25或普通冰箱上层冰盒中，可用一个月左右。0.001 M ADP溶液：称取ADP钠盐0.233g，加蒸馏水至1
4、00 ml，调节PH至7.4，保存于-25或冰箱上层冰盒中，可用一个月左右。,临用前，取上述（1）（2）（3）试剂各10 ml混合。在此混合底物液30 ml中，加入盐酸半胱氨酸0.105g，调节PH至7.4。此试剂最好新鲜配制，也可以保存于冰盒中。一般可放5-7天，若空白管光密度太高，说明有游离肌酸产生，即不能再用。0.3 N 氢氧化钡溶液 称取氢氧化钡（Ba(OH)28H2O）4.73g，加蒸馏水使之溶解（可加热助溶），并稀释到100 ml。5%硫酸锌溶液称取硫酸锌（ZnSO47H2O）8.82g，加蒸馏水溶解，并稀释到100 ml。上述2、3两种溶液配好后，需进行滴定，即吸取5%硫酸锌溶液
5、5 ml，放入50 ml三角烧瓶中，加入酚酞指示剂2滴，用0.3 N Ba(OH)2溶液滴定至出现粉红色30秒钟不褪色为止。Ba(OH)2用量与ZnSO4相等，如不相等，可稀释较浓的溶液。,标准肌酸溶液（1.7M/ml）准确称取无水肌酸22.3mg，置于100ml容量瓶中，加蒸馏水使之溶解，并稀释到刻度，置冰箱中保存，可用数日。双乙酰液 先配成1%溶液，置棕色瓶中放冰箱保存。临用时用蒸馏水稀释20倍。贮存碱溶液 称取30g NaOH，无水碳酸钠（Na2CO3）64g，加蒸馏水使溶解并稀释至500 ml，室温低时可析出沉淀，此时应放于37水浴中待沉淀溶解后再使用。-萘酚溶液 称取-萘酚1g，用上
6、述贮存碱液使溶解，并稀释到100 ml，此液必须新鲜配制，否则空白管光密度读数增高。,4 实验方法与步骤肌酸磷酸激酶显色法,肌酸磷酸激酶显色法。测定CK活性原理：利用上述反应所生成的肌酸与-萘酚和双乙酸反应，生成红色化合物。在一定范围内，红色深浅与肌酸含量成正比，与同样处理的肌酸标准液比色，求得酶的活力。,测定操作步骤（如下表3-14）：表3-14 单位：ml,计算：,肌酸磷酸激酶检测试剂盒法：,原理ATP+葡萄糖 葡萄糖-6-磷酸+ADP 为作用酶葡萄糖-6-磷酸+NADP+6-磷酸-葡萄糖+NADPH+H+为作用酶,器材与试剂：试管、可见光分光光度计、电子分析天平、采血装置（注射器）、水浴
7、锅、离心机、试剂盒测定法。如：采用中生北控生物科技股份有限公司生产的肌酸磷酸激酶检测试剂盒，该试剂盒适用于全自动，半自动生化分析仪及分光光度计测定人血清中CK的酶活浓度。基本参数：波长：340 nm，温度：25,30,37，比色杯光径：1cm。,原装试剂杂2-8避光保存，有效期12个月。复溶后在2-8可稳定7天，在15-25可稳定12小时。,试剂盒主要成分与浓度，见表3-15：表3-15 肌酸磷酸激酶检测试剂盒成分与浓度,混合均匀，在37温育2分钟后，读取初始吸光度，然后在精确1分钟，2分钟，3分钟时分别读取吸光度，确定每分钟平均吸光度变化A。,表3-16 肌酸磷酸激酶检测试剂盒的操作,操作步
8、骤：取一定量R2（参看R1瓶签）复溶1瓶R1，溶解后即为工作液。工作液预先保温至测试温度。,计算：CK（U/L）=（A样品/分A空白/分）F F=(Vt/Vs消光系数)1000=8095（37）Vt=反应总体积 Vs=样品体积 NADPH在340 nm波长下毫克分子消光系数=6.3 参考值：男：24-195 U/L；女：24-170 U/L 线性上限：CK活力可达1500U/L（37）注意事项：当A/分大于0.0360（F=4127），0.0190（F=8095）时，样品用生理盐水稀释后重新测定，结果乘以稀释倍数；试剂空白吸光度大于0.6时,勿用；血清CK不稳定，样品收集后要尽快分析，在室温4
9、小时，在4 8-12小时后，CK活性即要下降。,5 注意事项,5 注意事项,红细胞中肌酸磷酸激酶活力很低，故溶血标本不影响测定结果。混合底物的pH要求准确。氧氧化钡和硫酸锌要滴定至恰好等量，否则离心后会出现混浊。特别是钡离子多时，不能完全被硫酸根清除尽，使显色混浊而影响测定结果。肌酸磷酸激酶活力单位定义：以1 ml血清在37与底物作用1小时，生成1M肌酸为1个肌酸磷酸激酶活力单位。酶的活力太高时，应将血清用Tris-HCl缓冲液稀释后再行测定，结果乘以稀释倍数。因-萘酚本身颜色不恒定，试剂空白每次深浅不同，故不能用标准曲线工作法。,6 思考题,6 思考题,血清CK活性是赛前进行机能评定的一项重要指标，试述其理由。采血时挤压组织对结果有何影响？,
