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1、,2023/10/12,1,第二章 实验室设备和培养条件,在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。,2023/10/12,2,第一节 实验室设计,植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。,2023/10/12,3,实验室的大小取决于工作的目的和规模：,1.以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产影响效率。2.在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来设计,避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。,一、标准的组织
2、培养实验室,洗涤室（准备室）配置室 灭菌室 接种室 培养室 观察室,2023/10/12,4,2023/10/12,5,1.准备室 器具的洗涤、干燥、消毒,配置室 进行药品的保存、配置、消毒、分装,3.灭菌室 培养基及使用器具的消毒与灭菌,2023/10/12,6,准备室的设置及配备,2023/10/12,7,4.接种室 进行材料的接种，内置超净工作台或接种箱。外设缓冲间,放置拖鞋、工作服、工作帽,5.培养室 将接种的材料进行无菌培养生长的场所,6.细胞学观察实验室 进行培养材料的组织学、细胞学观察照相等,接种室的设置和配备,2023/10/12,8,接种室(外设缓冲间),培养室,2023/1
3、0/12,9,第二节 基本仪器设备与用品,2023/10/12,10,（一）仪器设备,1.超净工作台(cleaning table):用于培养物的无菌操作（由鼓风机、滤板、操作台、紫外灯和照明灯组成）。超净台分水平式和垂直式二种型号,2023/10/12,11,2.高压灭菌锅（手提式、立式或卧式）用于进行培养基和器械用具的灭菌。小规模实验室可选用小型手提式高压灭菌锅,卧式灭菌锅,手提式灭菌锅,3.恒温培养箱:用于植物材料的培养，其内有温度感受器，控制箱内温度到所调指标。生化培养箱还配有光照装置,2023/10/12,12,培养箱,2023/10/12,13,电子天秤,4.电子分析天平和托盘天平
4、：电子分析天平，用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品精确度为0.0001g；托盘天平用于称取用量较大的糖和琼脂等，其精确度为0.1g。天平应放置在干燥、不受震动的天平操作台上。,5.酸度计：首次使用酸度计前，应用标准液调节定位，然后固定。测量pH值时，待测液必须充分搅拌均匀。如果培养基温度过高，测量时要调整pH值计上的温度扭使之和培养基温度相当。,2023/10/12,14,6.烘箱：用于干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌和测定干物重。用于干燥需保持80-100；进行干热灭菌需保持150，达1-3h；若测定干物重，则温度应控制在80烘干至完全干燥为止。,烘 箱,7.显微镜,显微
5、镜,8.培养架：放置培养材料9.紫外线杀菌灯：杀菌10.定时器：控制光照时间11.普通冰箱：主要用于贮存母液、各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料等12.大型工作台:其高度应方便配制工作。13.药品柜:用于放置常用药品。14.解剖镜：种类较多，用于分离微茎尖可采用双筒实体解剖镜。解剖镜上带有照相装置，根据需要随时对所需材料进行摄影记录。,2023/10/12,17,2023/10/12,18,（二）小型用品,1镊子类(forceps)常应用医疗上的镊子,根据操作需要有各种类型,2剪刀类(scissors)可采用医疗五官科用的中型剪刀。主要用于切断茎段、叶片等。也可以用弯形剪刀，由于其头部弯
6、曲，可以深入到瓶口中进行剪切。,2023/10/12,19,3.解剖刀:切割较小材料和分离茎尖分生组织时，可用解剖刀。刀片要经常调换，使之保持锋利状态，否则切割时会造成挤压，引起周围细胞组织大量死亡，影响培养效果。,4.解剖针:解剖针可深入到培养瓶中，转移细胞或愈伤组织。也可用于分离微茎尖的幼叶，可以自制。,1.组培瓶（玻璃）-要求透光度好，能耐高压高温,以试管、三角瓶、培 养皿等使用较多。2.三角锥瓶-适用于各种培养（如固体培养、液体培养、大规模培养或一般培养）。3.培养皿-适于作单细胞的固体平板培养、胚和花药培养和无菌发芽。4.试管-适合于用少量培养基及试验各种不同配方时选用。,2023/
7、10/12,20,（三）玻 璃 器 皿,5.培养器皿还可就地取材，采用一些代用品。工厂化生产可采用广口的200ml罐头瓶。6.培养容器和制备培养基所需的玻璃器皿逐渐被塑料器皿所代替。塑料容器具有质轻、透明、不易破碎、成本低等优点。7.瓶口封塞可用多种方法，要具有一定的通气性和密闭性，以防止培养基干燥和杂菌污染。现在多采用聚丙烯塑料薄膜作为封口,为了增加通气性，可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸.也可采用专用的封口膜。,2023/10/12,21,在组织培养中配制培养基，贮藏母液，材料的消毒等需要各种化学实验用的玻璃器皿.包括各种型号的烧杯、量筒、移液管、试剂瓶、容量瓶、试管以及移液管架、酒精、玻璃棒
8、、滴瓶等等。,2023/10/12,22,第三节 培养条件,在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、PH值、渗透压等各种化学环境条件都回影响组织培养育苗的生长和发育。,2023/10/12,23,一 温度,但是，不同植物培养的适温不同。温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度，也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽的形成以28为最好，在12以下，33以上形成率皆最低。白鹤非的最适温度是20、月季是2527、番茄是28。,2023/10/12,24,温度是植物组织培养中的重要因素，大多数组织培养在2327之间进行，一般采用252。低于15时培养，植物组织会表现生长停止
9、，高于35时对植物生长不利。,(二)光照,组织培养中光照也是重要的条件之一主要表现在 光强、光质、光照时间,2023/10/12,25,2023/10/12,26,1 光照强度,光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光照强度对外植物体、细胞的最初分裂有明显的影响。,光照强度：1000lx1500lx黑暗条件：利于细胞、愈伤组织的诱导增殖光照条件：利于器官的分化,百合珠芽：在红光下培养8周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下培养，十几周后才出现愈伤组织，唐菖蒲子球块：接种15天后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。杨树：对愈伤组织生长红光促进蓝
10、光阻碍,2023/10/12,27,2 光质,光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响,研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织，在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，如葡萄，茎切段培养在短日照下形成根。,2023/10/12,28,3 光周期,试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗,（三）湿度,1.容器内湿度水平主要受培养基水分含量和封口材料的影响。前者又受琼脂含量的影响。在冬季应当适当减少琼脂用量，否则，将使培养基干硬，以致不利于外植体接触或插进培养基，导致生长受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况，但封闭性较高的封口
11、材料易引起透气性受阻，也会导致植物生长发育受影响。,2023/10/12,29,湿度的影响包括培养容器内湿度的保持和环境的湿度条件,2023/10/12,30,2.环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发，一般要求70%-80%的相对湿度，常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。,（四）渗透压,培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此，而影响到渗透压的变化。通常1-2个大气压对植物生长有促进作用，2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而5-6个大气压植物生长就会完全停止，6个大气压植物细胞就不能生存。,2023/10/12,31,（五）pH值,不同的植物对培养基最适PH值的要求也是不同的,大多
12、在56.5左右，一般培养基皆要求5.8，这基本能适应大多数植物培养的需要。PH值适度因材料而异，也因培养基的组成而不同。,2023/10/12,32,以硝态氮作氮源比以铵态氮作氮源PH值较小一些 一般来说pH值高于6.5时，培养基会变硬；低于5时，琼脂不能很好地凝固。因为高温灭菌会降低pH值（约个pH值）因此在配制时常提高pH值单位。pH值大小调节可用0.1M的NaOH和0.1M的HCl来调整。1ml的NaOH可使PH值升高0.2单位，1ml的HCl可使PH值降低0.2单位。调节时一定要充分搅拌均匀。,2023/10/12,33,（六）气 体,氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引起污染。固体培养基可加进活性炭来增加通气度，以利于发根。培养室要经常换气，改善室内的通气状况。液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等。,2023/10/12,34,复习思考题,(1)因地制宜建一个组织培养实验室，需要哪些分实验室?各分室的作用是什么?(2)常规组织培养时，需要什么设备和器械?怎样使用?(3)组织培养中，pH值起什么作用?如果pH值过高或过低会有什么后果?(4)如何根据外植体的不同调整适宜的培养温度?,2023/10/12,35,
