家畜繁殖学第八章配子与胚胎生物工程.ppt

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1、第八章 配子与胚胎生物工程,Chapter 8 Biotechnologies of Gametes and Embryos,第一节 胚胎移植技术 Section 1 Embryo transfer第二节 体外受精 Section In vitro fertilization第三节 克隆技术Section Animal cloning,本章内容,第四节 转基因技术 Section Transgenic Animal第五节 性别控制技术 Section Sex control第六节 胚胎干细胞的分离培养技术Section Embryonic stem cells technique第七节 哺乳动

2、物嵌合体的生产Section Chimera,第一节 胚胎移植技术,本节重点,胚胎移植的生物学基础与原则；供体超数排卵程序的制定；胚胎采集的方法。,一、概 述（一）概念 胚胎移植（embryo transfer，ET）：又称受精卵移植，是将体内或体外生产的哺乳动物早期胚胎移植到同种的生理状态相同的雌性动物生殖道内，使之继续妊娠发育为新个体的技术，也称借腹怀胎。提供胚胎的个体供体（donor）接受胚胎的个体受体（recipient）,为了使供体多排卵，通常采用超排（superovulation）；国外将常规的胚胎移植称为超数排卵胚胎移植或称为多排卵胚胎移植（multiple ovulation

3、and embryo transfer，MOET）；目前，用体外生产胚胎（in vitro production,IVP）技术或克隆（cloning）技术等方法也可以生产胚胎，扩大了优质胚胎的来源，降低了ET的成本。,（二）发展历史 1890年剑桥大学Walter Heape从一头纯种安哥拉母兔取出2个4细胞胚胎，移植到一头纯种比利时母兔输卵管上端(用同种公兔交配后3h),结果生出了4只比利时种仔兔和2只纯种安哥拉仔兔。,这一结果说明早期发育的胚胎更换到另一个体的输卵管(或子宫角)内，如果胚胎的发育阶段和所处的环境条件相适应，它完全可以继续正常发育，并成长为一个新个体。,国外胚胎移植技术的发展

4、历史,我国胚胎移植技术的发展历史,（三）,二、胚胎移植的生理学基础与基本原则,（一）生理学基础,（二）胚胎移植遵 循的基本原则,（三）开展胚胎移植 的条件,1.胚胎移植的生理学基础,2.胚胎移植的基本原则,同一解剖位置：空间环境的一致性,同一生理阶段：受体和供体在发情时间上的同期性,同一物种：供体和受体在分类学上的相同属性,胚胎的 质量,胚胎必须是正常的，并在处理过程中不受不良因素的影响。,包括人员的技术水平及所需的设备；,从良种母畜获得大量胚胎。,3.开展胚胎移植的条件,三、胚胎移植的技术程序,良种公畜,牛胚胎移植技术路线示意图,（一）ET的实际效果 1、胚胎来源 1）排卵率 2）回收率 3

5、）受精率 2、胚胎冷冻和胚胎分割的应用,四、ET的实际效果和影响妊娠率的因素,（二）影响妊娠率的因素,胚 胎 因 素,母 体 因 素,其 他 因 素,五、ET存在的主要问题,胚胎来源有限,缺乏熟练的技术人员,胚胎冷冻技术不完善,费用高、要求高,手术法容易出现粘连的问题,1、牛胚胎移植技术应用前景 因为牛的经济价值高、单胎、繁殖周期长、常年发情，所以采用胚胎移植技术生产优质奶牛、肉牛，正适于当今国内奶牛、肉牛生产旺盛需求，其更具广阔发展空间和持续发展前景。2、羊胚胎移植技术应用前景 相比之下，羊的经济价值不及牛，繁殖率较牛高，繁殖周期较牛短，且移植术目前仅限于手术法，供体可利用次数少等因素制约。

6、但从近期发展态势看，又强于牛，其主要原因是：优质羊价位高，公母羊都有一个良好市场。,六、胚胎移植的发展前景（以牛、羊为例）,概念、意义及 发展历史,IVF的基本程序,IVF的应用前景,第二节 体外受精,1、概念：在自然条件下，哺乳动物精子和卵子的受精过程是在体内完成的。如将精子和卵子分别从公、母畜体内取出并经过一系列的处理，使精卵在体外条件下结合的过程，称为体外受精(in vitro fertilization，IVF)。由于卵子和精子的受精过程是在实验室中完成，故通过这一技术而产下的动物又称为“试管动物”，如“试管牛”、“试管猪”、“试管婴儿”等。,一、概念、意义及发展历史,2、发展历史,早

7、在1878年，德国人Scnenk就以家兔和豚鼠为材料，开始探索哺乳动物的体外受精技术，但一直没有获得成功。直到1951年，美籍华人张明觉和澳大利亚人Austin同时发现了哺乳动物的精子获能现象，这一领域的研究才获得突破性进展。1959年，张明觉以家兔为实验材料，从一只交配后12h的母兔子宫中冲取精子(即体内获能的精子)，从另外两只超数排卵处理母兔的输卵管中收集卵子，精子和卵子在体外人工配制的溶液中完成受精过程，然后，正常卵裂的36枚胚胎被移植到6只受体的输卵管中，其中4只妊娠，并产下15只健康仔兔，这是世界上首批试管动物，它们的正常发育标志着体外受精技术的建立。,20世纪60年代初至20世纪8

8、0年代中期，人们以家兔、小鼠和大鼠等为实验材料，进行了大量基础研究，在精子获能机理和获能方法方面取得很大进展。精子由最初在同种或异种雌性生殖道孵育获能，发展到用子宫液、卵泡液、子宫内膜提取液或血清等在体外培养获能，最后用化学成分明确的溶液培养获能。同时，通过射出精子和附睾精子获能效果的比较研究，人们发现射出精液中含有去能因子，并认识到获能的实质是去除精子表面的去能因子。这些理论和方法上的成就，推动了体外受精技术的发展，试管小鼠(Whittingham，1968)、大鼠(Toyoda和Chang，1974)、婴儿(Steptoe和Edwards，1978)、牛(Brackett等，1982)、山

9、羊(Hamda，1985)、绵羊(Hanada，1985)和猪(Chang等，1986)等相继出生。,20世纪80年代中期以后，以牛为代表的家畜IVF技术发展迅速，1986年Parrish等用含肝素的介质处理牛的冷冻精液，然后与体外成熟的卵母细胞体外受精获得成功。这对牛IVF的研究和应用具有重要意义，因为这种方法可利用屠宰场废弃的卵巢和冷冻精液进行胚胎体外生产，不仅成本低廉，而且效果稳定。此后，牛的卵母细胞体外成熟和胚胎培养体系逐步趋于成熟，胚胎体外生产效率得到很大提高。目前，采用IVF-ET技术，每对废弃的牛卵巢可获得3头左右的犊牛。为充分利用良种母牛的遗传资源，20世纪80年代后期，牛的活

10、体取卵技术（Ovum pick UP.OPU）发展迅速。活体取卵和IVF-ET结合已成为欧、美和大洋洲等畜牧业发达国家的农场主为扩大良种母牛群选择的重要繁殖技术。牛的体外受精技术不仅应用于畜牧生产，同时，也成为研究其他胚胎生物技术，如克隆、转基因、胚胎干细胞分离培养和性别控制等的重要辅助手段。,体外受精技术的发展简史,（1）研究哺乳动物配子发生、受精和胚胎早期发育机理。（2）在家畜品种改良中，体外受精技术为胚胎生产提供了廉价而高效的手段，对充分利用优良品种资源，缩短家畜繁殖周期，加快品种改良速度等有重要价值。（3）在人类，IVF技术是治疗某些不孕症和克服性连锁病的重要措施之一。（4）体外受精技

11、术还是哺乳动物胚胎移植、克隆、转基因和性别控制等现代生物技术不可缺少的组成部分。,3、意义,二、体外受精的基本操作程序,卵母细胞的体外成熟（in vitro maturation,IVM）,卵子和精子的体外受精（in vitro fertilization,IVF）,受精卵的体外培养（in vitro culture,IVC）,1、离体卵巢采卵：从屠宰母畜的卵巢上采 集卵母细胞,（一）卵母细胞的采集和成熟培养,（1）卵泡抽吸法,（2）卵巢切割法,2、活体采卵：从活母畜的卵巢上采集卵母 细胞（优良品种）B超引导法：借助超声波(B超)探头和屏幕的引导，从活母畜卵巢采集卵母细胞。操作员先将带有B超探

12、头和采卵针的采卵器通过阴道插入子宫，同时通过将卵巢贴在探头上。根据B超屏幕所显示的卵泡位置，利用采卵针穿刺卵泡并同时抽吸卵母细胞。,1）培养液：用于卵母细胞体外成熟的最为广泛基础培养液是M199。培养时尚要加入一定的血清和激素。2）温度和气相：牛、猪、羊和马等家畜的卵母细胞体外成熟培养的温度一般为3839。所有哺乳动物卵母细胞体外成熟培养的气相一般要求在含5C02的空气和最大湿度的环境。3）培养时间：牛和羊卵母细胞体外成熟培养的时间一般为2224h，而马为3036h，猪为4044h。4）培养方法：卵母细胞体外成熟的培养方法一般采用微滴法、封闭法和开放法三种。,3、卵母细胞的体外成熟（IVC）,

13、1、精子的制备：悬浮法（swim up）、直接离心法、哌可（Percoll）密度梯度离心法2、精子获能处理：肝素处理法、钙离子载体法、高渗 溶液处理法3、受精液：通常使用Tyrodes改良液和BO液4、受精方法：微滴法、四孔培养板法5、精卵共培养的时间、温度和气相：受精后，卵母细胞应立即放入温度39，含5CO2的空气和最大相对湿度的CO2培养箱中培养2444h，其中牛2224h，将假定的受精卵从受精液中取出，再在早期胚胎体外培养液中继续培养1833h。受精后4044h检查受精卵的分裂率,（二）卵母细胞的体外受精（IVF）,1、培养液：基本成分主要包括无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物和蛋白质等

14、。2、胚胎体外培养系统：常规培养系统、输卵管离体培养系统、与体细胞共培养系统。3、培养方法：卵子在受精24h后，转移到预先制备好的颗粒单层中继续培养。一般使用微滴培养法。4、培养的温度和气相环境：和卵母细胞成熟的条件一样。5、胚胎的回收及其质量评定：以牛为例，整个体外受精程序，从卵母细胞成熟培养开始，经过体外受精和体外培养直至受精卵发育到囊胚阶段，一共经历8d的时间。如定受精当天为0d，则受精后第56d即可回收桑椹胚，第78d回收囊胚。,（三）早期胚胎的体外培养（IVC）,三、家畜体外受精技术的发展现状和存在的问题,（一）发展现状,（二）存在的问题和发展方向,1、存在的问题）囊胚发育率低，细胞

15、数少。）产仔率低，胎儿初生重高。,2、发展的方向）深入研究卵母细胞成熟和胚胎发育的分子机理；）加强腔前卵泡的培养研究，充分利用优良母畜的遗传资源；）加强体外受精与其他生物技术的结合。,四、辅助受精技术(assisted fertilization),通过对哺乳类配子进行显微操作以协助其受精的技术称为显微受精。,活精子,透 明 带 下 注 射,透 明 带 钻 孔,透 明 带 部 分 切 口,卵母细胞质内注射,精液的利用率可成百万倍的提高，可以使优良种公畜得到最充分的应用；精子的保存技术将大为简化，将来或许只要精子核物质完整就可以达到受精的目的，这对世界珍稀动物资源的保护将产生深远的影响；与其他技

16、术结合，如将已经过性别鉴定的精子注入卵子受精，可人为控制家畜后代的性别。,显微受精技术在动物受精和发育机理研究、畜牧 业生产及人医临床实践中有着广阔的应用前景：,第三节 克隆技术Animal cloning,一、概述二、胚胎分割三、单个卵裂球分离培养四、细胞核移植,定义：是指由一个细胞或个体以无性繁殖（asexual reproduction）或孤雌生殖而产生方式产生遗传物质完全相同的一群细胞或一群个体。内容：,一、概述,克隆技术,广 义,狭 义,胚胎分割,细胞核移植,胚胎细胞核移植,体细胞核移植,一、胚胎分割,胚胎分割：运用显微操作系统将哺乳动物附植前胚胎分成若干个具有继续发育潜力部分的生物

17、技术，从而可获得同孪生后代。,（一）发展史,（二）胚胎分割的基本程序,分割器具的准备,胚 胎 预 处 理,胚 胎 分 割,分割胚的培养,分割胚的保存和移植,体视显微镜,倒置显微镜,显微操作仪,桑椹胚之前的胚胎分割,桑椹胚和囊胚的分割,卵裂球培养示意图,牛 桑 椹 胚 胎 分 割,二、囊胚的分割（续）,1,2,3,牛囊胚的分割,（三）技术进展,1、出生重低,2、遗传一致性,3、异常与畸形,4、同卵多胎的局限性,二、单个卵裂球分离培养,定义：把动物早期胚胎分离成单个卵裂球，再把卵裂球单独培养为正常胚胎，然后移植给受体得到克隆后代。,机械切开透明带吸取卵裂球,蛋白酶溶解透明带再吸取卵裂球,方法,三、

18、细胞核移植,细胞核移植：是指将一个供体核通过显微操作方法移植到一个核受体中，组成核质杂合细胞，这种核质杂合细胞也叫作重构胚。,细胞核移植,胚胎细胞核移植,体细胞核移植,（一）发展史,1、胚胎细胞核移植,2、体细胞核移植,胚胎细胞核移植,体细胞核移植,细胞核移植的方法,动物核移植技术程序,（二）细胞核移植的操作程序,1、核供体细胞的准备 1）核供体细胞种类 初期胚胎细胞 ES细胞 各种体细胞：如胎儿成纤维细胞，乳腺细胞，皮肤细胞（耳、成体、胎儿），肌肉细胞，卵丘细胞，内脏细胞（肝、脾、心、肺、肠、舌）生殖系列细胞：PGCs、精母细胞、足细胞和精巢细胞,胚胎细胞作为核供体先用1%的链酶蛋白酶或pH

19、2.5的台氏液去掉透明带，再用机械吹打或酶消化发使其分散为单个游离的卵裂球。一般选择1632-细胞期或晚期桑椹的胚胎细胞较为合适。,2）核供体细胞的准备,体细胞作为核供体经0.25%胰蛋白酶+0.1%EDTA消化后，将细胞接种培养于DMEM。之后放入5%CO2培养箱中培养，待细胞长至70%80%时进行传代。传代38代的细胞用于核移植。胚胎干细胞作为核供体ES细胞既具有胚胎细胞所不具备的数量优势，又具有体细胞所不能保持的低分化。ES细胞是全能的，在一定条件下，它可以分化成各种功能细胞。,2、核受体细胞的准备,1）核受体细胞的种类 去核卵母细胞 去核合子 去核2-细胞期胚胎的卵裂球,选择细胞：采用

20、去核的MII期卵母细胞作为受体胞质。去核：受体MII期卵母细胞需要进行去核。方法：盲吸法，荧光引导去核法，微分干涉及极性显微镜去核法，离心去核法，化学试剂去核法，末期去核法，吸引法去核，挤压法去核，点击法去核,2）受体卵母细胞的准备,荧光引导去核法 用Hoechst 33342（28mg/ml）染色1015min，然后在荧光显微镜下确定核的位置,离心去核法：根据细胞核的密度大于细胞质，用离心的方法可使没有透明带的卵母细胞核被甩向一侧而最后脱离卵母细胞。化学试剂去核法：用化学试剂处理处于第一次减数分裂中期的小鼠卵母细胞，使染色体相互紧密结合，形成染色体复合体，在卵母细胞排出PB1时，染色体复合体

21、随PB1一起排出。末期去核法：激活处理成熟卵母细胞，使其排出PB2，然后吸取其周围附近的细胞质。吸引法去核：在注入核供体的同时吸引除掉原有卵母细胞核。,挤压法去核 在PB1附近，将透明带切开，调准切口，固定卵 母细胞，使切割针与其成垂直方向，向下挤压除 去PB1连同下面的一小部分细胞质,点击法去核 在PB1附近，将卵母细胞透明带切开1/3，调准切口，使其与切割针成垂直方向，固定卵母细胞，用显微 针点击透明带，除去PB1连同下面的一小部分细胞质。,1）化学法2）仙台病毒法3）电融合法,4、细胞融合系统,1）化学激活7%乙醇：处理时间57min离子霉素：4umol/L，5min钙离子载体（A231

22、87）：5umol/L，5min6-DMAP：1.92.0mmol/L；35h或更长星形胞菌素：2umol/L；1530min2）电激活,5、激活系统,6、核移植重构胚的培养体内培养：用琼脂包埋，移入中间受体（如羊、兔）的输卵管内，培养45d后回收胚胎进行移植。体外培养：重组胚激活后，在现有的胚胎体外培养系统中进行培养。7、继代细胞核移植 又叫连续细胞核移植，即将核移植胚胎的卵裂球分开，作为供核细胞，再进行连续多代的核移植，以便从一枚胚胎得到更多的克隆胚胎。8、克隆胚胎的移植 先做同期发情处理，然后将胚胎移到受体动物如牛和水牛的黄体侧子宫角。,结果不稳定，效率低（16%）；克隆动物怀孕期长、出

23、生体重异常偏大、生后对环境的适应性差；存活率低细胞质的遗传问题,（三）核移植技术存在的问题,1、扩大优良畜种和稀有动物的数量2、提高转基因动物效率3、核-质间互作关系的研究4、克隆技术的医学价值,（四）核移植的应用前景,核移植产生的弥猴,美国俄勒岗州灵长类研究中心通过早期胚胎卵裂球移植入卵母细胞后产生的幼猴。,第四节 转基因技术动物 Transgenic Animal,一、概述二、哺乳动物转基因技术的研究意义三、哺乳动物转基因技术的主要环节四、哺乳动物转基因技术存在的主要问题,转基因技术：通过一定方法把人工重组的外源DNA导入受体动物的基因组中或把受体基因组中的一段DNA切除，从而使受体动物的

24、遗传信息发生人为改变，并且这种改变能稳定地遗传给后代的技术。通过转基因技术诱导基因组改变的动物称转基因动物(transgenic animal）。,一、概述,1976年Jaenisch等获得含有SV40 DNA的嵌合体小鼠。1980年，Gordon应用显微注射法首次成功地将重组的外源DNA直接注入小鼠受精卵雄原核中，获得了携带外源基因小鼠。1982年，Palmiter将大鼠的生长激素基因用微注射方法导入小鼠的受精卵中获得巨型小鼠（supermouse），从而在理论上和实践意义上都将转基因技术提高一步，引起生物学界极大的关注，为基因工程育种提供诱人的前景。早期以提高生长为主，以生产药用蛋白和可移

25、植的器官,发展史,十大神奇转基因动物,这些五彩斑斓的脑细胞是单个的神经元，鲜艳的色彩帮助科学家将它们区分开来。英国哈佛大学的杰夫-里奇曼为首的科研小组在实验鼠的基因组中导入水母的绿色荧光蛋白基因，使其在紫色光线的照射下呈现出绿色荧光。这种绿色荧光基因对小鼠无害，只起到标记作用。,荧光鼠,我们所有人都听说过蜘蛛侠，但是你听过蜘蛛山羊吗？这种转基因山羊是独一无二的，因为它们能产生普通的蜘蛛丝。这种构成蜘蛛网的同样物质由它们的乳腺产生。很多科学家把蜘蛛丝叫做“生物钢”，有着超强的抗张强度。研究人员称，如果把很多蜘蛛丝拧成一股绳的话，它足够强韧，可制成防弹背心、降落伞绳，或者从飞机到航母等设备。蜘蛛丝

26、还可被制成人造韧带和人造腱，支撑组织、骨骼和神经细胞，让它们在生长期间保持稳定。随着细胞的逐渐生长，这些人造丝部分会逐渐分解。但蜘蛛与蚕不同，把很多蜘蛛放在一起它们会彼此蚕食。因此，科学家始终致力于想出集中生产蜘蛛丝的方法。帮助“生产”这些山羊的怀俄明大学分子生物学家兰迪-刘易斯说：“从概念上讲，这个过程非常简单。用于丝蛋白的蜘蛛丝基因与控制蛋白质构成组织的山羊的DNA有关。在这种情况下，它是乳腺，只形成于哺乳期。然后，细胞与卵结合生成胚胎，胚胎有着合成其DNA的基因。当母羊开始分泌乳汁时丝蛋白就产生了。”,美国研究人员通过一项新技术，使得老鼠具有了抵抗各种癌症的能力，而这个科学突破将使癌症患

27、者有望接受无副作用的治疗。这些老鼠内产生的一种蛋白质是未来疗法的关键，它能消灭肿瘤细胞，却不会伤害体内的健康组织。通常情况下，一般的癌症治疗会使患者出现疼痛、恶心和掉头发等情况。科学家们希望有朝一日把这种蛋白质用于癌症患者身上，使他们摆脱这些痛苦。这个突破取决于一种叫Par-4的老鼠基因，它生产这种蛋白质。研究人员让一组老鼠拥有比正常情况下更多的蛋白质。癌症研究杂志报道，后来他们发现，这些老鼠对许多癌症类型产生免疫力，像肝癌和前列腺癌等。测试显示，这种蛋白质还能抵抗乳腺癌、胰腺癌和头颈癌等。美国的这些科学家们表示，至关紧要的一点是这些老鼠没有出现任何明显的副作用。,翡翠海参看起来更像一片树叶，

28、而不是黏滑的腹足软体动物，但它却是已知第一种在自然演化过程中发生转基因现象的物种。这种生物令很多科学家大惑不解。就像缅因大学的玛丽-朗波发现，它们居然能够利用水藻食物中的叶绿体进行光合作用以产生能量。没有任何其他动物能够这样利用叶绿体。朗波研究发现海参中的一种基因与水藻中具有光合作用的基因类似，这表明在过去的漫长岁月中，该基因或许通过自然进化的方式从水藻转移到海参的DNA中。虽然目前还很难证实海参身上的这种基因转移，但朗波仍表示“我们正致力于探究这种转移是如何发生的”，这将有利于科学家探索动植物间的基因转移是否会发生在其他的物种上。,2003年，美国得克萨斯的一家公司宣布，经过转基因技术他们已

29、经研制出能发荧光的小型热带鱼“荧光鱼”。这种“光芒四射”的红色荧光鱼，是利用转基因技术得到商标注册的第一种商业性荧光宠物鱼。改基因后的斑马鱼散发出粉红色荧光，远看像金鱼一样。目前，公司以GloFish的商标对红色荧光鱼进行了注册，这标志着转基因荧光鱼可以被当作家庭宠物出售。斑马鱼是一种常见的观赏鱼，身上有黑白相间的条纹。荧光斑马鱼被分别转入了水母绿色荧光蛋白或者珊瑚虫红色荧光蛋白的基因，在紫外线的照射下，能够发出绿光或红光。荧光鱼作为观赏鱼在市场上销售，是第一种上市的转基因动物。针对改基因荧光鱼的研发，环保人士提出了担忧，认为“异类鱼”投放大自然后会给生态平衡带来毁灭的影响，也认为转基因鱼可能

30、会给人的身体健康带来影响。,蚊子属于昆虫纲双翅目蚊科，全球约有3000种，是一种具有刺吸式口器的纤小飞虫。通常雌性以血液作为食物，而雄性则吸食植物的汁液。吸血的雌蚊是登革热、疟疾、黄热病、丝虫病、日本脑炎等其他病原体的中间寄主，能传播多种疾病，是人类健康的“杀手”之一。近年来，全世界科学家都在努力研究转基因蚊子，以降低其对人类的危害。伦敦帝国学院的科研小组培育了一种转基因蚊子，其中的雄性具有荧光睾丸，很容易被识别，然后令其不育。研究者称，可以将大量这样的转基因蚊子放到野外与普通的雌蚊交配，减少疟蚊的产卵量，从而慢慢减少疟蚊的数目。这种转基因蚊子没有生育能力，所以不会将基因遗传给野生蚊子。美国科

31、学家通过基因改造，在实验室中培育出了一种蚊子，它具备了不再感染疟疾的能力，将这些蚊子放入野外可以有效切断人与蚊子之间的疟疾传播途径。这些经过基因改造的蚊子被饲以未感染疟原虫的血液时并无明显优势，不过在饲以含有疟原虫的血液后，比普通蚊子更能适应环境。这意味着，跟普通的蚊子相比，这种转基因蚊子的繁殖能力和生存能力更强，死亡率更低。被疟原虫感染不会杀死普通蚊子，但是会降低其繁殖率。,一种超级老鼠可以不知疲倦地奔跑数小时、寿命更长、拥有更强繁殖能力、吃得更多而不增加体重美国科学家培育出的这种转基因老鼠震撼了世界，引起人们的遐想：培育超级老鼠的技术手段能否应用于人类，改善人类的能力？第一只超级老鼠诞生于

32、大约4年前。如今，科学家已经培育出500只超级老鼠。研究者将高度活跃的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK-C)基因注入老鼠胚胎。基因转化的老鼠在运动时有效利用身体脂肪产生能量，同时避免产生大量乳酸。乳酸可导致肌肉痉挛，即使耐力最强的运动员也会发生肌肉痉挛。科学家汉森教授说，超级老鼠主要利用脂肪转化能量，体内只产生非常微量的乳酸，它们不吃不喝也能跑4到5个小时。这种老鼠最多能以每分钟20米的速度奔跑6公里，也就是说，它能连续不间断奔跑5个小时甚至更多。科学家说，这相当于一个人不间断地高速骑自行车翻越阿尔卑斯山，只有人类顶级运动员可以做到，比如环法自行车赛七冠王兰斯-阿姆斯特朗。,曾培育出世界上第一

33、只克隆羊“多利”的英国罗斯林研究所，近日又取得了一项重大的科学突破：该研究所的科学家成功培育出世界上第一批能下“神奇鸡蛋”的小鸡。这种经过基因改造的小鸡所下的蛋能用来制造治疗癌症和其他疾病的药物。这一重大科学突破无疑为大规模生产药物提供了非常广阔的前景。科学家用于研究的小鸡名为“依沙褐壳蛋鸡”，这种法国品种鸡每年可下约300颗鸡蛋。经过基因改造后的“依沙褐壳蛋鸡”，其DNA中含有人为加入的人类基因，当母鸡生下蛋后，科学家就能从鸡蛋的蛋白中提取用来制造药物的蛋白质。牛津生物医药公司的研究人员安德鲁-伍德表示：“从理论上来说，这种技术适用于不同种类的基因，因此这些母鸡也可以被用于制造许多不同的蛋白

34、质。未来，这种技术有望用于治疗包括帕金森症、糖尿病和多种癌症在内的各种疾病。”,日本科学家最近通过改变老鼠的基因，培育出了一只不怕猫的老鼠。在科学家展示的照片中，一只褐色老鼠离一只猫不到一英寸，在猫的身边嗅来嗅去。长期以来，科学家们一直认为，动物的恐惧可能是由它们灵敏的嗅觉唤起的。老鼠拥有大约1000个嗅觉感受器基因，而人类只有400个起作用的和大约800个不活跃的嗅觉感受器基因。在用老鼠所做的一项实验中，研究人员确认并移除了老鼠大脑嗅球上的某些感受器，结果这些老鼠变成了一群无所畏惧的啮齿动物，在天敌面前转来转去，显示出极强的好奇心，永远不知道危险的存在。,携带细菌基因的转基因猪可产生更清洁，

35、污染更少的绿肥。这些基因，可帮助猪除去食物中的磷酸盐，从而有助减少猪畜牧业中产生的对农业有害的废物。在加拿大圭尔夫大学的猪研究小组成员Serge Golovan说：“植物含有许多有机磷，而普通猪不能使用它。”没吸收的磷流散在环境中，危害溪流中的生物，产生温室气体。转基因猪经过遗传修饰，在唾液中产生肌醇六磷酸酶，从而可以吸收植物中的磷，而普通猪是不能消化磷的。对转基因猪产生的肥料进行分析发现，他们比普通猪的排磷量减少了75%。圭尔夫大学研究小组使用来自大肠杆菌的肌醇六磷酸酶基因，将该基因插入到猪基因组中，猪的唾液中产生这种酶。这种污染性小的猪所排泄的磷比食用肌醇六磷酸酶的猪要少得多,二、哺乳动物

36、转基因技术的研究意义,在基础生物学中,在基础医学研究中,在畜牧业中,研究真核细胞的基因转录、表达和调控规律以及个体发育的分子调控规律。,遗传疾病的DNA被克隆后，通过转基因技术制备动物疾病模型，可研究遗传疾病的发生、发展规律和治疗方案 的选择。,生长激素或促生长因子基因加快生长速度，提高饲料报酬；病毒衣壳基因提高疾病抵抗力；药用蛋白或营养蛋白与组织特异性表达调控元件偶联，用于家畜造血系统或泌乳系统生产 药用蛋白或营养蛋白，提高畜牧业经济效益；转基因猪的器官作为人类器官移植的供体，解决器官移植过程中供体相对不足的问题。,1、目的基因克隆和体外重组 1）人工合成 2）互补DNA（cDNA）的克隆

37、3）DNA克隆2、外源基因的导入,三、制备转基因动物的基本程序,显微注射法,反转录病毒感染法,胚胎肝细胞法,精子载体法,细胞核移植法,生殖细胞转染法,1）显微注射法-微注射法（microinjection）它是创造转基因动物的有效途径。,2）逆转录病毒介导法,3）胚胎干细胞法,4）精子载体法 意大利Lavitrano等1989年首次报道利用精子作为载体获得了转基因小鼠。,5）细胞核移植法,6）生殖细胞转染法,3、外源DNA整合、转录及表达的分子检测,1）外源基因的整合检测:检测动物基因组中是否携带外源DNA。方法是先扩增目的基因，再通过电泳检测是否含有目的基因，最后用Southern杂交检测P

38、CR阳性个体是否含目的基因。2）外源基因的转录检测：用Northern杂交法检测转基因动物某一组织的mRNA进行分析检测，出现阳性表明外源基因具有转录活性。3）外源基因的表达检测：转基因动物组织中是否含有目的基因编码的外源蛋白质。常用酶联免疫法、免疫荧光法和Western杂交法。,四、哺乳动物转基因技术存在的主要问题,1、效率低，成本高2、外源基因的随机整合和异常表达3、转基因与动物保护的矛盾4、转基因动物释放及生物安全,五、哺乳动物转基因技术的发展趋势,1、提高效率，降低成本2、加强基因定点整合技术研究3、转基因技术的发展将对人类产生深刻的影响,第五节 性别控制技术 Sex Control,

39、一、性别控制技术定义和意义二、性别控制技术的发展概况三、哺乳动物的性别控制技术四、性别控制技术的发展前景,三、性别控制技术,性别控制,（一）定义：指通过对动物正常生殖过程进行人为干预，使成年雌性动物产出人们期望性别后代的一种繁殖新技术。受精之前通过在体外对精子进行干预，使在受精之前便决定后代的性别。受精之后通过对胚胎性别鉴定，从而获得所需性别的后代。,一、性别控制的定义和意义,1、可使受性别限制的生产性状（如泌乳性状）和受性别影响的生产性状（如肉用,毛用性状等）能获得更大的经济效益。2、可增强良种选种中的强度和提高育种效率,以获得最大的遗传进展。3、对人类来说,通过精子性别的选择,可以避免怀孕

40、一个与X相关隐性疾病的婴儿。而与X相关的隐性疾病至今已有370多种。,（二）性别控制的意义,二、性别控制技术的发展概况,1、1906年Stevens和Wilson，以昆虫为研究对象，首先发现精子中X染色体,Y染色体。2、1923年Painter发现人精子中的X染色体,Y染色体。3、1959年Welshons和Jacobs等提出Y染色体决定雄性的理论。4、1966年Jacobs发现雄性性别决定因素位于Y染色体的短臂。5、1989年Palmer等找到了Y染色体上的性别决定区（sex determing region of the Y chromosome,SRY)。6、1992年英国的剑桥Mast

41、ercalf公司利用分离的精子和体外受精技术得到性控犊牛。,（一）X和Y精子的分离 1、X和Y精子的差异：X精子染色体含量高于Y精子 Y染色体上有特异SRY序列 2、X、Y精子分离：采用流式细胞器分类法，根据两类精子头部DNA含量的差异进行分离。在家畜中，X精子的DNA含量比Y精子高出3%-4%。,三、哺乳动物的性别控制技术,各种动物X、Y染色体DNA含量差异,精子分离流程示意图,1、核型分析法 1）定义：分析部分胚胎细胞的染色体组成判断胚胎性别的方法。2）原理：取一部分细胞，先用秋水仙素处理，再固定染色，检查性染色体，根据染色体中期的谱带差异、Y染色体的大小及形态判断性别。3）优点：准确率可

42、达100%4）缺点：对胚胎损伤大，操作时间长，获得高质量染色体中期分裂相难。5）应用：常采用切割胚，一半用于鉴定性别，一半用于冷冻或移植。,（二）早期胚胎的性别鉴定,2、SRYPCR鉴定法,1）定义：雄性特异性DNA探针和PCR扩增技术对早期胚胎进行性别鉴定的一种新方法。2）原理：先从胚胎中取出部分卵裂球，提取DNA，然后用SRY基因一段碱基作引物，以胚胎DNA 为模板进行PCR 扩增，再用SRY特异性探针对扩增产物进行检测或对扩增产物进行电泳，通过检测SRY基因条带的有无判定雌雄。3）优点：取样少，对胚胎损伤小，操作时间短，准确率可达90%以上。4）缺点：成本高，偶尔出现假阳性。,1)定义：

43、利用H-Y抗血清或H-Y单克隆抗体检测胚胎上是否存在雄性特异性H-Y抗原，从而进行胚胎性别鉴定的一种方法。2）原理：雄性胚胎存在雄性特异性组织相容性抗原（H-Y抗原）。3）方法：细胞毒性分析法、间接免疫荧光法和囊胚形成抑制法。细胞毒性分析法：在补体（豚鼠血清）存在的情况下，H-Y抗体可以与H-Y阳性雄性胚胎结合，使卵裂球溶解，破坏胚胎的发育。,3、免疫学方法,囊胚形成抑制法：H-Y抗体可以可逆性的抑制囊胚的形成。间接免疫荧光法：间接免疫荧光法是以H-Y抗体作为第一抗体，以异硫氰酸荧光素（FITC）标记的山羊抗鼠r-球蛋白作为第二抗体。将上述两种抗体依次与胚胎共同培养，雄性胚胎上的抗原先与第一抗

44、体结合，第一抗体再与第二抗体结合，通过洗涤，将没有结合到胚胎上的第二抗体去除，由于第二抗体是荧光标记的，所以在荧光显微镜下观察，有荧光的为雄性胚胎，无荧光的为雌性胚胎。4）缺点：弱抗原，结果不稳定，准确率低。,提高精子分离的速度。提高SRY-PCR的灵敏度和可操作性。,四、性别控制技术的发展前景,第六节 动物胚胎干细胞的分离培养技术 Embryonic Stem cells,一、概述 二、胚胎干细胞研究的意义三、胚胎干细胞研究的历史四、胚胎干细胞分离培养的基本程序 五、胚胎干细胞技术目前存在的问题和 发展远景,哺乳动物胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES细胞）一般是指从早

45、期胚胎经体外分化抑制培养分离出来的具有全能性的细胞系。ES细胞是由Evans和Kauf-man1981年首次从延迟小鼠囊胚中分离出来的多能性细胞，当时称之为EK细胞。以后称之为胚胎干细胞。,一、概述,ES细胞的特点：,ES细胞具有胚胎细胞的特性，在形态上表现为体积小、核大，核仁突出，培养时呈克隆状生长；在功能上，ES细胞具有发育的全能性，即具有分化为成年动物体内任何一种细胞类型的能力。ES细胞具有细胞系的特征，在饲养层上能维持未分化状态并实现自我更新。因为可无限增殖，也可冷冻保存。,ES细胞在哺乳动物个体发生发育规律的研究中极有价值的工具；ES细胞是研究细胞分化的理想手段；ES细胞是研究基因功

46、能的首选细胞；ES细胞作为生产转基因动物的主要途径之一；ES细胞治疗技术将引起一场医学革命；ES细胞可用于研究细胞癌变机理和新药物的筛选。,二、胚胎干细胞研究的意义,三、胚胎干细胞研究的历史,1981年 Evans 和 Kaufman 小鼠ES细胞系1988年 Doetschman 仓鼠ES细胞系1994年 Wheeler 和Robert 猪ES细胞系1998年 Thomson 人ES细胞系2007年 Yamanaka和James Thomson 诱导多能性干细胞（induced pluripotent stem cell，iPS细胞）,1、饲养层培养体系：培养皿底部制备饲养层，然后把胚胎培养

47、在饲养层上。饲养层细胞一般分裂缓慢，经过射线或丝裂霉素C处理获得。其特点是分泌白血病抑制因素或分化抑制因素。2、条件培养体系：胚胎直接培养在条件培养液中，不需要制备饲养层。条件培养液是把一些细胞培养一段时间后再回收的培养液。这些细胞在生长过程中分泌白血病抑制因素。3、培养液中添加分化抑制因子体系：将分化抑制因子直接按一定浓度加入细胞培养液中。这体系既能避免饲养层细胞的干扰，也能避免丝裂霉素C对胚胎的毒害作用。,四、胚胎干细胞分离培养的基本程序,(一)选择抑制细胞分化的培养体系,（二）早期胚胎的选择 动物品种不同，胚胎的发育阶段也不同。如小鼠的桑椹胚、囊胚和延迟着床的囊胚，人和猪的囊胚和原生生殖

48、细胞中均可获得ES 细胞。（三）胚胎干细胞的分离 分离ES细胞的第一步是获得胚胎内细胞团，然后把它分成单个细胞，再放入分化抑制培养体系中继续培养，以获得ES 细胞克隆。（四）胚胎干细胞的保持 分离得到ES细胞以后，为克服长期培养对其遗传物质的影响，采取一定方法维持其未分化状态。常规保持：不断更换培养液，以传代培养方式维持其快速繁殖和抑制分化状态。冷冻保持：超低温冷冻保存使细胞的代谢完全停止。,（五）胚胎干细胞的鉴定 包括细胞中有较高水平的端粒酶和碱性磷酸酶以及细胞表面出现的阶段性胚胎抗原。（六）胚胎干细胞的分化潜力验证 ES 细胞具有形态和生化特征外，还具有较高分化潜能。ES 细胞注入囊胚腔后

49、必须参与三个胚层的形成。体外培养时，分化诱导剂可诱导定向分化。,1、根据细胞的分化特点建立更有效的培养体系2、加强胚胎干细胞体外诱导分化研究3、提高家畜胚胎干细胞的分离水平4、加速胚胎干细胞在医学上的应用,五、胚胎干细胞技术目前存在的问题和发展远景,第七节 嵌合体（Chimera）,定义：指由2个以上不同的受精卵或3个以上的配子相结合，有不同基因型的细胞群所构成的复合体。嵌合体动物制作方法：1、集合（凝集）法：在卵裂阶段使2个以上的胚胎发生粘着和结合。2、注入法：在临近着床的胚泡期，用显微操作方法将另一个体的细胞注入到囊胚腔中。,研究现状：家畜的嵌合体不但已在个体间和品种间取得成功（绵羊、牛和

50、猪等），而且在异种间也得到了活的后代，如绵山羊人工嵌合体，该技术对遗传学研究具有重要意义，塑造特异性状的新奇物种，从而为动物园展示了新的前景，嵌合体也被用来研究免疫学系统的机理。,（一）供体和受体母畜的选择,供体 具有遗传优势，在育种上有相当高的育种价值；具有良好的繁殖能力，无生殖道疾病，产后60d以上；牛年龄3-5岁；体质强健，健康无病，营养良好的母畜作供体；受体 应繁殖性能好，对地方适应性强，容易购买，体型中上等的母畜，如本地牛羊及生产性能低的其它牛羊；牛年龄3-5岁；受体健康状况良好，已进入发情季节；供、受体发情时间应接近或一致,1、同期发情的定义定义：是对具有正常发情周期的群体母畜采取