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1、第四章微生物反应器操作,主要内容 1、微生物反应器操作基础 2、分批操作 3、流加操作 4、连续操作,4.1 微生物反应器操作基础,微生物培养过程根据是否要求供氧，分为厌氧和好氧培养。,好氧培养可采用以下几种方法：（1）液体表面培养（如使用浅盘）；（2）通风固态发酵；（3）通氧深层培养。,深层培养,培养方式分类：分批式操作（batch operation）半分批式操作（semi-batch operation）反复分批式操作（repeated batch operation）反复半分批式操作（repeated semi-batch operation）连续式操作（continuous oper
2、ation),4.2 分批式操作,是指基质一次性加入反应器内，在适宜条件下将微生物菌种接入，反应完成后将全部反应物料取出的操作方式。,培养过程中基质体积变化,半分批式操作 又称流加操作，是指先将一定量基质加入反应器内，在适宜条件下将微生物菌种接入反应器中，反应开始，反应过程中将特定的限制性基质按照一定要求加入到反应器内，以控制限制性基质保持一定，当反应终止时取出反应物料的操作方式。酵母、淀粉酶、某些氨基酸和抗生素等采用这种方式进行生产。,反复分批式操作是指分批操作完成后，不全部取出反应物料，剩余部分重新加入一定量的基质，再按照分批式操作方式，反复进行。其培养过程中基质体积变化曲线如图4-1c所
3、示。反复半分批式操作是指流加操作完成后，不全部取出反应物料，剩余部分重新加入一定量的基质，再按照流加操作方式进行，反复进行。其培养过程中基质体积变化曲线如图4-1d所示。,连续式操作是指在分批式操作进行到一定阶段，一方面将基质连续不断地加入反应器内，另一方面又把反应物料连续不断的取出，使反应条件（如反应液体积等）不随时间变化的操作方式。活性污泥法处理废水、固定化微生物反应等多采用连续式操作。连续培养过程中基质体积变化曲线如图4-1e 所示。,分批式操作特点,4.2.1 生长曲线,分批培养中微生物的生长曲线如图4-2。随培养的进行，基质浓度下降，菌体量增加，产物量相应增加。分批式培养过程中，微生
4、物的生长可分为：1、迟缓期（lag phase)；2、对数生长期（lagarithmic growth phase）；3、减速期（fransient phase）；4、静止期（stationary phase）；5、衰退期（decline phase）5个阶段。,分批式培养中微生物的生长曲线,4.2.2 状态方程式,分批式培养过程的状态方程式（环境过程的状态方程式）可表示为：基质：dS/dt=-yX菌体：dX/dt=X产物：dP/dt=X氧：CO2：,当t=0时,上式中，F为惰性气体流速，V为反应液总容积，Pall为气体总压力，(Po2)out为排气中氧的分压，(Po2)in为进气体中氧的分压
5、，(Pco2)in为进气体中C02的分压，(Pco2)out为排气中CO2的分压。,一般微生物的最适温度、最适pH的范围较窄。例如，Calam等人研究了温度对产黄青霉（Penicillum chrysogenum）生长速率和青霉素生成速率的影响，发现最适生长温度为30，进行呼吸的最适温度为21.728.6，产物青霉素的最适生成温度为24.7。生产中一般采用定值控制。在这样的条件下，可以认为分批培养过程中的动态特性取决于基质与微生物浓度（接种量）及微生物反应的诸比速率的初始值，因此，支配分批式培养统的主要因素是基质与微生物的浓度的初始值。,分批式微生物反应过程分析中，需观察X，S和P等随时间的变
6、化情况。由于不可能研究所有反应液成分随时间的变化，因此应选择与产物P关系最为密切的底物S作为观察的对象。必要时，可观察两种基质浓度的变化。好氧反应中，溶解氧浓度（DO）随时间的变化也是很重要的参数。,4.2.3 反复分批操作 反复分批操作系统（图4-3）中培养液体积为V，培养液取出率为，滤液取出率为，由于V一定，所以培养液加入量为。为确保菌体初始浓度一定，有必要将流出液中部分含菌体的培养液取出，此时菌体量的衡算式为：,反复分批操作示意图,由上式可知 产物浓度的衡算为由上式，滤液取出率为,产物的生产能力 由上式可知，为提高产物生产能力，可采取提高或减少tRB。,4.3 流加操作,流加操作的优点是
7、能够任意控制反应液中基质浓度。流加操作的要点是控制基质浓度，因此，其核心问题是流加什么和怎么流加。在工程上特别要注意后者。从流加方式看，流加操作可分为无反馈控制流加操作与反馈控制流加操作。前者包括定流量流加、指数流加和反馈控制流加操作等。后者分间接控制、直接控制、定值控制和程序控制等流加操作。,流加培养操作,流加操作时，特定基质加入到反应器后，反应液体积就会发生变化，这时、和的可定义如下：式中，V为反应液体积，F是体积流量，Sin是流加液中的基质浓度，FSin为基质的质量流量。,4.3.1 无反馈控制的流加操作 采用这种操作方式时，基质的流加按预先设置好的条件进行。因此，表达系统的数学模型是否
8、正确成为反应成败的关键。最简单的微生物的生长速率为,作为流加基质的平衡式，有,反应液体积变化的方程式为,式中，Kvap为单位时间里由于通气，随排出气体而失去的水分。如果流加的基质能够迅速并完全为菌体所消耗，并且维持代谢为零时，可得到最大的菌体浓度Xmax。由于基质流加量与基质消耗量相等，可认为，这样由流加基质的平衡式有,对于所供给基质的浓度，菌体浓度近似一定，即dX/dt=0时。由上式，可认为（D稀释率）。,一、定流量流加操作 定流量流加操作是指基质的流加速度保持一定的流加操作。此时。时间时，由菌体的恒算式,可知，时间t时的菌体浓度为,这种流加方式的最大特点是微生物进行线型生长（linear
9、growth），即 式中KL是线性生长速率常数。一般，在线性生长阶段，基质浓度相当低。,二、指数流加操作 通过采用随时间呈指数性变化的方式流加基质，维持微生物菌体的对数生长的操作方法称为指数流加操作。此时，以满足等于定值为基础，流加基质，由Monod方程可获得S=常数。此时，由于dX/dt=0，结合前述的拟稳定状态条件，有如下方程式,基于上式，菌体量为,流量为,从以上结果可知，采用这种方式操作，不仅能保证微生物呈指数生长，而且能保持基质浓度一定。流加基质浓度Sin与反应器内反应液最终体积、最终菌体量Xf和菌体收率YX/S有如下关系：,拟稳定状态下初始流加速度F0可由（4-24）给出。,微生物每
10、次培养都可能有微妙的变化，因此，无反馈控制的流加操作适用范围很窄。,4.3.2 有反馈控制的流加操作,阴沟肠杆菌定流量流加培养,甘油为基质进行阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）定流量流加培养的实验结果与计算机模拟结果如前图。图中（a）是甘油水溶液为流加基质的结果，如图4-4所示的那样，菌体浓度一定（XV以直线方式增加）。图中（b）甘油直接为流加基质，与甘油水溶液的不同，流加的基质全部被消耗，反应液的体积V一定，菌体浓度X按照直线方式增加。此时，确保了高浓度培养的成功。,4.4连续式操作,连续操作有两大类型，即CSTR（continuous stirred tank reac
11、tor）型和CPFR(continuous plug flow tulular reactor）型。根据达成稳定状态的方法不同，CSTR型连续操作，大致可分为三种。一是恒化器法（chemostat），二是恒浊器法（turbidstat），第三是营养物恒定法（nutristat）。,恒化器法是指在连续培养过程中，基质流加速度恒定，以调节微生物细胞的生长速率与恒定流量相适应的方法。恒浊器法是指预先规定细胞浓度，通过基质流量控制，以适应细胞的既定浓度的方法。营养物恒定法是指通过流加一定成分，使培养基中的营养成分恒定的方法。实际应用中多采用恒化器法。,单级CSTR培养系统,4.4.1 恒化器法连续操作
12、,1、单级连续培养操作 上图所示的单级CSTR培养系统中，流入液中仅一种成分为微生物生长的限制性因子，其他成分在不发生抑制的条件下充分存在。反应过程中，菌体、限制性基质及产物的物料衡算式为 变化量=流入量+生成量-流出量 由于流入液中菌体与产物的浓度为零，因此，上述衡算式写成数学表达式为,式中，F为反应液流入与流出速度L/h，V为反应器内反应液的体积L，Sin为流入液中限制性底物的浓度mol/L，S为反应器内和流出液中限制性底物浓度mol/L，其余符号同前。,以上式子两边同除以V，则,式中，D称为稀释率(dilution rate）,根据菌体得率和的定义式，以及Monod方程，可改写成,稳定状
13、态下，dX/dt=dS/dt=dP/dt=0，此时的菌体浓度、基质浓度和代谢产物浓度可分别表示为,事实上D是有一定限制的，就是要保证，即,微生物反应一般是在 条件下进行的，所以由上式，可以认为 当D值接近 时，实际上X为零，此时 转变为 此时称为冲出（wash out）点，称为冲出基质浓度。也就是微生物的生长速度低于反应液流加速度时，反应液中微生物将全部被排出。当然，这已无连续操作的意义，但这一过程可用来确定此条件时微生物的。,另外，给出稳定状态下菌体生长速率和产物生成速率，即,所以获得最高产物产率时的稀释率为,此时，最高代谢产物浓度为,最高产率时的菌体浓度为,面包酵母的连续培养中，最大产率的
14、 确定是一个优化问题。事实上，最大生产能力是在接近最大稀释率时达到的，其可能与基质的利用率存在矛盾。经验表明，时，基质利用率仍可能大于95%。,连续培养为目的微生物选择了有利的生长环境，提高了竞争的优势，有利于减少杂菌污染的机会。另外，连续培养过程中的菌种变异问题也是不可轻视的。DNA的复制是一种复杂而精确的过程，虽然出现差错的概率仅1/106，但因每ml反应液中往往有109个细胞，所以变异问题显得很重要。当然，在这一数量中，多数突变是不重要的。有人研究了工程菌株连续培养的理论问题，多数情况下，只有保持一定的选择压力，工程菌株一样可以稳定。,3、多级连续培养多级连续培养系统是一具有n个串联反应
15、器的连续反应系统。底物流经这一系统的流量为F，由物料衡算可得出菌体X、产物P及限制性基质S的衡算式。这些方程式成立的基本条件是，限制性基质由n-1号反应器流入n号反应器中立即与n号反应器内的反应物料充分混合均匀。其有关衡算式为,稳定状态下，以上三式左边为零。因此，有,从以上式子可以分析得出，从第二级开始，菌体的比生长速率不再与稀释率相等。另外，有关具有反馈的多级连续培养操作方程可采用前面所述方法推导出来。,2、具有反馈的单级连续培养 有时为了增加反应器内的菌体浓度，或者在某种条件下提高发酵产物的产率，对于单级连续培养可以采取将反应器排出液中的部分微生物重新返回反应器中。图4-9表示具有反馈的单
16、级连续培养系统，图中g为微生物的浓缩系数（1），r为再循反应液的比例（返回的反应液与供给的新鲜反应液的体积比）。稳定状态时，菌体的物料衡算式为,整理得,由此求得稀释率为,在这种情况下，D为“外部”稀释率，对于反应器本身，还要用一个“内部”稀释率D的概念，它等于D加上rD，,反馈过程中，必须满足g1,r0这样,因此函数值,大于，即,由于的绝对值必须小于1，因此，r和g在一定范围内是互相依存的，不能任意选定。具有反馈的单级或多级连续培养中，稳态下的稀释率都高于比生长速率。这与常规单级连续培养（保持）不同。前者流入反应器的培养液体积要相对多一些。这一方法在生物法废水处理过程之一的活性污泥法中普遍采用
17、，因为其有利于提高除污能力。,理论上，反馈操作使菌体产率增大，但实际运用并不尽然。反应液中菌体的浓度取决于收率和底物消耗的数量，即 因此，无其它限制因子时，微生物菌体浓度在一定范围内受底物浓度的制约。如果采用控制底物浓度的方法来控制菌体浓度，可使无反馈反应系统中的菌体浓度达到反馈条件时的菌体浓度的同样数值，此时，反馈对于提高菌体产率并不显示优越性。相反，由于分离后反应液中菌体浓度降低，对菌体生产（如面包酵母生产）反而不利。,对于具有反馈的单级系统来讲，还要考虑排出反应液中菌体的浓度。菌体分离装置处的菌体恒算式为,所以，即菌体产率等于比生长速率与的乘积。由于具有反馈时的大于无反馈时的，因此，反馈使反应器的产率增加了倍。,所以，从菌体分离装置处流出的菌体浓度为,谢 谢 大 家,
