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1、1,细菌耐受噬菌体突变率的测定 微生物创新性试验第五组：,2,细菌耐受噬菌体的突变是一种自发突变，它的发生与环境因子无关，是随机的非定向突变。,本组设计性实验题目：测定铜绿假单胞菌耐受噬菌体的突变频率,3,实验选材依据和背景,铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa）原称绿脓杆菌。在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有本菌存在。本菌存在的重要条件是潮湿的环境。,4,革兰染色,培养,绿脓杆菌,研究背景,本菌为条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者，及术后或某些治疗后的患者易感本菌。筛选出优良菌种，以便
2、更好地利用其资源进行研究并造福人类。同时又对其外界环境有更大的适应性，更好应用于发展、生产的需要。为获得其菌群，我们采用利用噬菌体将其敏感细菌杀死，从而选择耐受细菌。,5,6,研究概述,研究方案：为获得其菌群，我们采用噬菌体将敏感细菌杀死，将发生了耐受突变的细菌选择出来，并繁殖成为优势菌群。,研究意义：培养出优势菌群，为以后临床治疗及临床用药起辅助性作用。,研究目的：测定细菌自然情况下耐受噬菌体的自发突变频率。,研究问题：突变率测定,实验材料,1.毒性噬菌体及其相应的敏感宿主菌。（建议使用人体正常菌群中的细菌及其噬菌体，如大肠埃希菌或铜绿假单胞菌及其相应噬菌体。）2.LB液体培养基及LB固体培
3、养基。3.试管、培养皿、刻度定量吸管。4.酒精灯、接种环、显微镜、普通培养箱等。,7,LB是什么？,LB：Luria-Bertani培养基，即溶菌肉汤。,8,实验步骤,9,1.准备好铜绿假单胞菌的过夜培养物和相应的噬菌体原液（噬菌体效价1010）,铜绿假单胞菌的倒置过夜培养物,噬菌体原液,实验步骤,2.将菌液10倍连续稀释，至少稀释7管，取0.1ml涂布接种LB琼脂平板，37度培养过夜。次日取菌落适宜于菌落计数的平板进行CFU计数，计算出每毫升菌液中的CHU数：CFU数=每个平皿中的CFU数10血清稀释倍数,10,2.,11,10倍连续稀释，至少7管,CFU是什么？,CFU(Colony-Fo
4、rming Units)：菌落形成单位,菌落形成单位。将稀释后的一定量的菌液通过浇注或涂布的方法，让其内的微生物单细胞一一分散在琼脂平板上，待培养后，每一活细胞就形成一个菌落。与常规利用显微镜对微生物数量进行测量不同，主要是对可见（即多数情况下形成菌落）的细菌数量进行测量的单位。单位：CFU/mL。指的是每毫升样品中含有的细菌群落总数，也有用CFU/g即对应固体培养基。,12,通俗的解释,是指每毫升菌液中含有多少单细胞。传统上就叫“个”。但是，我们知道，一个菌落不一定是一个细菌所生成，也可能是由一簇细菌（一个细菌团）所生成，这时候再叫“个”就不太准确啦，准确的叫法就是“菌落形成单位”，英文缩写
5、“CFU”。就像“公斤”和“千克”，只是叫法不同，数量上没有变化。,13,实验步骤,3.进入对数生长后期的大肠埃希菌或铜绿假单胞菌，菌数约为109CFU/ml左右。23h后，可见菌液逐步变清，待完全变清（月4h之内），将全部菌液均匀涂布到一个LB琼脂平板上，置37下培养过夜。次日计数CFU。,14,4.耐受噬菌体突变频率的计算 第3步中获得的CFU数为1ml菌液中的耐受菌数量，第2步中获得的CFU数为1ml菌液中的总菌数。故：耐受噬菌体突变频率=,15,第3步中获得的CFU数第2步中获得的CFU数,实验可行性分析,1.标本采集方便 本菌在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。各种水、
6、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有本菌存在。本菌存在的重要条件是潮湿的环境。采自不同感染部位的标本，包括血液、尿液、痰标本、脓汁、穿刺液等。还包括来自医院环境中的各种标本如水、空气、物体表面采样等。,16,2.分离培养容易本菌生长对营养要求不高。3.生长特点明显该菌在4不生长而在42可以生长。（可用以鉴别）4.采用CFU计数的科学性。5.实验现象明显，便于观察。,17,预期结果,18,预期结果,经相关文献预测：铜绿假单胞菌耐噬菌体的突变机率在1.410-77.910-7之间。,19,讨论,上述操作3，通常在4h内菌液会完全变清。此时细菌尚处于生长曲线的“迟缓期”（即适应期），亦即尚未进入分裂状态。如果少数事先存在的耐受菌已进入分裂期，这是测定结果会被放大，因而失其准确性。,20,思考题,(1)为什么溶化后的培养基要冷却至45左右才能倒平板？(2)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？(3)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点。,21,参考文献,微生物学通报 MICROBIOLOGY 国际标准刊号：ISSN 0253-2654 国内统一刊号：CN 11-1996/Q 铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及耐噬菌体突变频率测定 张克斌 陈志瑾 等 第三军医大学基础部微生物学教研室,22,23,
