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1、微生物学,浙江工业大学生物技术系裘娟萍 钟卫鸿 邱乐泉 汪琨,第四节 培养基,培养基（medium，复数media；或culture medium）是指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合营养料。（参见P91）,任何培养基都应具备微生物所需要的六大营养要素，其间的比例是合适的？,碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水,link1,绝大多数微生物都可在人工培养基上生长，只有少数难养菌（fastidious microorganisms）至今无法在人工培养基上生长。,一、选用和设计培养基的原则和方法（一）配制培养基的4个原则 1.目的明确,培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；
2、培养目的不同，原料的选择和配比不同；,例如枯草芽孢杆菌：一般培养：肉汤培养基或LB培养基；自然转化：基础培养基；观察芽孢：生孢子培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；,根据不同的工作目的，微生物不同的营养需要，运用自己丰富的生物化学和微生物学知识来配制最佳的培养基。,微生物细胞组成元素的调查或分析，是设计培养基时的重要参考依据。,2.营养协调,微生物细胞内各种成分间有一较稳定的比例。,在大多数化能异养菌的培养基中，各营养要素间在量上的比例大体符合以下十倍序列的递减规律：,要素：含量：,H2O(10-1),C源+能源(10-2),N源(10-3),K、Mg(10-5),P、S(1
3、0-4),生长因子(10-6),实验室的常用培养基：细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；放线菌：高氏1号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：查氏合成培养基；,实验室一般培养：普通常用培养基；遗传研究：成分清楚的合成培养基；生理、代谢研究：选用相应的培养基配方；,（1）选择适宜的营养物质,营养物质的浓度适宜；营养物质之间的配比适宜；,高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而起到抑制或杀菌作用。,（2）营养物质浓度及配比合适,培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和（或）代谢产物的形成和积累，其中碳氮比（CN）的影响较大。,
4、link2,发酵生产谷氨酸时：碳氮比为4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；碳氮比为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量则大量增加。,真菌需CN比较高的培养基；（素食）细菌（动物病原菌）需CN比较低的培养基；（荤食）,NH3 CO(NH2)2 NH4NO3(NH4)2CO3(NH4)2SO4,含氮量（82）（46）（35）（29.2）（21）,在同样重量时，在以上各氮源中含氮量以氨为最高，尿素次之，硝酸铵和碳酸铵更次之，而硫酸铵则最低。,3.理化适宜,指培养基的pH值、渗透压、水活度和氧化还原电势等物理化学条件较为适宜。,pH渗透压和水活度氧化还原电位,（1）pH,各大类微生物都有其生长适宜
5、的pH范围，培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。,细菌：pH 7.08.0放线菌：pH 7.58.5酵母菌：pH 3.86.0霉菌：pH 4.05.8藻类：pH 6.07.0原生动物：pH 6.08.0,嗜极菌（extremophiles）,初始pH,通常培养条件：,在微生物的生长、代谢过程中会产生引起培养基pH改变的代谢产物，为了维持培养基pH的相对恒定，通常要进行pH的调节。,pH的内源调节,pH的外源调节,pH的调节,（2）渗透压和水活度,它表示两种浓度不同的溶液间被一个半透性薄膜隔开时，稀溶液中的水分子会因水势（water potentia
6、lity）的推动而透过隔膜流向浓溶液，直到浓溶液产生的机械压力足以使两边水分子的进出达到平衡为止，这时由浓溶液中的溶质所产生的机械压力，即为它的渗透压值。,渗透压（osmotic pressure）是某水溶液中一个可用压力来量度的一个物化指标。,与微生物细胞渗透压相等的等渗溶液最适宜微生物的生长；高渗溶液会使细胞发生质壁分离；低渗溶液则会使细胞吸水膨胀，形成很高的膨压，这对细胞壁脆弱或丧失的各种缺壁细胞，例如原生质体、球状体或支原体来说，则是致命的。,是一个比渗透压更有生理意义的一个物化指标。它表示在天然或人为环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水的含量。,水活度的定量涵义,水活度即aw（w
7、ateractivity）,（3）氧化还原电势（redox potential）,又称氧化还原电位，是度量某氧化还原系统中还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标。一般以Eh表示，它是指以氢电极为标准时某氧化还原系统的电极电位值，单位是V（伏）或mV（毫伏）。,不同类型微生物生长对氧化还原电位的要求不同,好氧性微生物：+0.1伏以上时可正常生长，以+0.3+0.4伏为宜；厌氧性微生物：低于+0.1伏条件下生长；兼性厌氧微生物：+0.1伏以上时进行好氧呼吸，+0.1伏以下时进行发酵。,氧化还原电位与氧分压和pH有关,也受某些微生物代谢产物的影响,增加通气量(如振荡培养、搅拌)提高培养基的氧分
8、压，或加入氧化剂，从而增加Eh值；在培养基中加入巯基乙醇、抗坏血酸（Vc，0.1%）、硫化氢(0.025%)、半胱氨酸（0.05%）、谷胱甘肽、铁屑、二硫苏糖醇、庖肉（瘦牛肉粒）等还原性物质可降低Eh值。,测定氧化还原电势除用电位计外，还可在培养基中加入化学指示剂刃天青（resazurin）进行间接测定。,在无氧条件下呈无色（Eh-40 mV）；在有氧条件下，其颜色与溶液的pH相关；（中性紫色；碱性蓝色；酸性红色）在微量氧时，它呈粉红色。,刃天青,4.经济节约,配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成份,特别是在发酵工业中,以降低生产成本。,（1）以粗代精,对微生物来说，各种粗原
9、料营养更加完全，效果更好。而且在经济上也节约。大量的农副产品或制品，如麸皮、米糠、玉米浆、酵母浸膏、酒糟、豆饼、花生饼、蛋白胨等都是常用的发酵工业原料,以野生植物原料代替栽培植物原料，如木薯、橡子、薯芋等都是富含淀粉质的野生植物，可以部分取代粮食用于工业发酵的碳源。,（2）以“野”代“家”,（3）以废代好,以工农业生产中易污染环境的废弃物作为培养微生物的原料。例如，糖蜜(制糖工业中含有蔗糖的废液)、乳清(乳制品工业中含有乳糖的废液)、豆制品工业废液、黑废液(造纸工业中含有戊糖和己糖的亚硫酸纸浆)等。工业上的甲烷发酵主要利用废水、废渣作原料,在我国农村，已推广利用粪便及禾草为原料发酵生产甲烷作为
10、燃料。,（4）以简代繁,某制药厂改进链霉素发酵液中的原有配方，设法减去30-50%的黄豆饼粉、25%的葡萄糖和20%硫酸铵，结果反而提高了产量。,（5）以氮代朊,以大气氮、铵盐、硝酸盐或尿素等一类非蛋白质或非氨基酸廉价原料用作发酵培养基的原料，让微生物转化成菌体蛋白质或含氮的发酵产物供人们利用。,（6）以纤代糖,开发利用纤维素这种世界上含量最丰富的可再生资源。将大量的纤维素农副产品转变为优质饲料、工业发酵原料、燃料及人类的食品及饮料。,（7）以烃代粮,以石油或天然气副产品代替糖质原料来培养微生物。生产石油蛋白；将石油产品转化成一些产值更高的高级醇、脂肪酸、环烷酸等化工产品和若干合成物；对石油产
11、品的品质进行改良，如脱硫、脱蜡等。,（8）以“土”代“洋”,以国产原料代替进口原料，尽量减少工业成本。国内青霉素发酵工业的迅速发展，依赖于找到了富有中国特色的培养基配方，即用廉价的棉子饼（或花生饼）和白玉米粉代替玉米浆和乳糖。,（二）4种方法 1.生态模拟,直接取用这类天然基质（经过灭菌）或模拟这类自然条件，就可获得一个“初级的”天然培养基来培养相应的微生物。,例如，用肉汤、鱼汁来培养细菌；用果汁来培养酵母菌；用润湿的麸皮、米糠培养霉菌；用米饭或面包来培养根霉；用肥土来培养放线菌；用玉米芯来培养脉孢菌（Neurosporaspp.）等。,2.参阅文献,（1）直接经验（2）查阅、分析和利用一切文
12、献资料上的对自己直接或间接有关的信息,中国期刊网（全文数据库）万方数据资源系统维普数据库生物引擎 生物通 生物桥,3.精心设计,设计、试验新配方,各项因素的比较或反复试验,优选法或正交试验设计法,工作量很大,4.试验比较,试验的规模一般都遵循由定性到定量、由小而大地逐步扩大的原则。,生态模拟,参阅文献,精心设计,试验比较,设计一种优化的培养基,例如，先在培养皿琼脂平板上测试某微生物的营养要求，然后作摇瓶培养（shake culture）试验，再进行台式发酵罐培养试验，最后才扩大到试验型发酵罐和生产型发酵罐的规模。,二、培养基的种类,培养基微生物的菜谱名目繁多、种类各异,（一）按对培养基成分的了
13、解作分类,天然培养基,组合培养基,半组合培养基,（二）按培养基外观的物理状态作分类,液体培养基,固体培养基,半固体培养基,脱水培养基,（三）按培养基对微生物的功能作分类,选择性培养基,鉴别性培养基,基础培养基,加富培养基,增殖培养基,（四）发酵工厂的培养基 1.种子培养基,为了在较短时间内获得数量较多的强壮而整齐的种子细胞，需要使用种子培养基。种子培养基营养丰富、氮源充足，由于用量不多，原料可使用较为精制的。,2.发酵培养基,发酵培养基适用于合成发酵产物的培养基，如果产物分子中以碳元素为主，发酵培养基中碳源含量就需高些，例如谷氨酸产物；如果产物分子中氮元素较多，氮源也要相应增加。,发酵培养基用
14、量很大，每天都需几十吨，因此要尽量选用成本较低的原料，选原料时还要考虑它对产品提取、工艺条件的影响。,3.保种培养基,保种培养基一般营养不需很丰富。,三、培养基的配制,配料,溶解,调pH,过滤,分装,灭菌,包扎,摆斜面,贮存,还没有完呢，稍等片刻！,本章小结,1.营养是一切生命活动所需物质之源,水 碳源 氮源,微生物6大类营养要素碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水,自养微生物，能源是日光能或还原态无机物；异养微生物，能源就是碳源。,2.微生物的营养类型,按微生物所需碳源和能源的性质分为四大类：化能异养微生物（最多）化能自养微生物光能异养微生物光能自养微生物,3.微生物的营养的方式,有细胞构
15、造的微生物营养方式都是渗透营养型。单纯扩散、促进扩散、主动运输和基团移位,4.设计和配置培养基的原则和方法,4个原则：目的明确、营养协调、理化适宜和经济节约4个方法：生态模拟、查阅文献、精心设计和试验比较,4.培养基的种类,天然培养基、组合培养基和半组合培养基；液体培养基、半固体培养基和固体培养基；基础培养基、加富培养基、增殖培养基、选择性培养基和鉴别培养基；种子培养基、发酵培养基和保种培养基。,复习思考题,设计一张表格，比较一下微生物6类营养要素。2.设计表格，比较微生物的4大营养类型。3.设计表格，比较四种营养物质进入细胞的方式。4.对培养基的种类列表表示。,下节课再见了,是指寄生或共生的
16、微生物，Eg.类支原体（MLO）、类立克次氏体（RLO）和少数寄生真菌等。,难养菌（fastidious microorganisms）,碳氮比（CN）比：,碳源含量,氮源含量,碳氮比（CN比）,碳源中碳原子的摩尔数,氮源中氮原子的摩尔数,内源调节主要有以下两种方法：,第一种是采用磷酸缓冲液进行调节。,pH的内源调节,通过培养基内在成分所起的调节作用，就是pH的内源调节。,调节K2HPO4和KH2PO4两者浓度比可获得pH 6.07.6间的一系列稳定的pH。,K2HPO4,KH2PO4,1时，溶液的pH稳定在6.8。,反应原理：K2HPO4HClKH2PO4KClKH2PO4KOHK2HPO4
17、H2O,第二种以CaCO3作“备用碱”进行调节。,CaCO3（不溶于水又是沉淀性的，在培养基中分布不均匀）、NaHCO3均可用来调节培养基的pH。反应是：,pH的外源调节,这是一类按实际需要不断从外界流加酸或碱液，以调整培养液的方法。,水活度定量涵义为：在同温同压下，,某溶液的蒸汽压,纯水蒸汽压,aw该溶液的百分相对湿度值（ERH，equilibrium relative humidity）,aw,各种微生物生长繁殖范围的aw值在0.9980.6之间。,back1,1.天然培养基（complex media，undefined media）,这是指一些利用动、植物或微生物体或其提取物制成的培养
18、基，这是一类营养成分既复杂又丰富、难以说出其确切化学组成的培养基。,例如，培养多种细菌的牛肉膏蛋白胨培养基，培养酵母菌的麦芽汁培养基等。,天然培养基的优点：营养丰富、种类多样、配制方便、价格低廉。缺点：是成分不清楚、不稳定，不适宜做精细的科学实验。,天然培养基只适合于一般实验室中的菌种培养、发酵工业中生产菌种的培养和某些发酵产物的生产等。,2.组合培养基（chemical defined media）,又称合成培养基或综合培养基（synthetic media），是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。,例如，培养细菌的葡萄糖铵盐培养基，培养放线菌的淀粉硝酸盐培养基
19、（即高氏一号培养基），培养真菌的蔗糖硝酸盐培养基（即察氏培养基）等。,组合培养基的优点：成分精确、重演性高。缺点：价格较贵、配制较烦，且微生物生长比较一般。,组合培养基仅适用于营养、代谢、生理、生化、遗传、育种、菌种鉴定或生物测定等对定量要求较高的研究工作中。,3.半组合培养基（semi-defined media）,又称半合成培养基（semi-synthetic media），指一类主要以化学试剂配制，同时还加有某种或某些天然成分的培养基。,例如，培养真菌的马铃薯蔗糖培养基 等。,严格地讲，凡含有未经特殊处理的琼脂的任何组合培养基，因其中含有一些未知的天然成分，故实质上都只能看作是一种半组合
20、培养基。,1.液体培养基（liquid media）,一类呈液体状态的培养基，在实验室和生产实践中用途广泛，尤其适用于大规模的培养微生物。,2.固体培养基（solid media）,广义：一类外观呈固体状态的培养基。狭义：在液体培养基中加入凝固剂，使之成为固体的培养基。,固体培养基为微生物生长提供一个营养表面，微生物在这表面上可以形成单个菌落。,（1）固化培养基（solidified medium）（2）非可逆性固化培养基（3）天然固态培养基（4）滤膜（membrane filter）,根据固体的性质又可把它分为4种类型：,固体培养基在科学研究和生产实践上具有广阔的用途，例如，可用于菌种的分离
21、、鉴定，菌落计数，检验杂菌，选种、育种，菌种保藏，抗生素等生物活性物质的生物测定，获取大量真菌孢子，以及用于微生物固体培养和大规模生产等。,3.半固体培养基（semi-solid media）,例如，“稀琼脂”（sloppy agar），它在小型容器倒置时不会流出，但在剧烈震荡后则呈破散状态。,指在液体培养基中加入少量的凝固剂而配制成的半固体状态培养基，,一般可在液体培养基中加入0.5左右的琼脂制成。,半固体培养基可放入试管中形成“直立柱”，这在微生物学实验中有许多独特的用途，例如，细菌的动力观察（在半固体直立柱中央进行细菌的穿刺接种，观察细菌的运动能力），微生物趋化性的研究，厌氧菌的培养、分
22、离和计数，细菌和酵母菌的菌种保藏，以及噬菌体效价测定（双层平板法）等。,4.脱水培养基（dehydrated culture media）,又称脱水商品培养基（dehydrated commercial media）或预制干燥培养基（pre-fabricated dried culture media）,指含有除水以外的一切成分的商品培养基，使用时只要加入适量水分并加以灭菌即可，是一类既有成分精确又有使用方便等优点的现代化培养基。,（1）固化培养基（solidified medium）,例如，加有12琼脂（agar）或512明胶（gelatin）的液体培养基，可制成遇热可融化、冷却后则呈凝固态
23、的用途最广的固化培养基。,常称“固体培养基”，由液体培养基中加入适量的凝固剂（gelling agent）而成。,凝固剂必须具有的特点：a.不被微生物液化、分解和利用b.在微生物生长的范围内保持固体状态c.凝固点的温度对微生物无害d.不因消毒灭菌的高温处理而破坏e.配制方便、价格低廉f.透明度好、粘着力强,常用的凝固剂：琼脂（agar）、明胶（gelatin）、海藻酸钠（alginate）、脱乙酰吉兰糖胶（Gelrite）、多聚醇F127（pluronic polyol F127）等。,琼脂是最优良的凝固剂，自1880年代开始用于配制微生物培养基以来，至今经久不衰。,除了用凝固剂配制固体培养基
24、外，一些天然的固体营养物质也能制成固体培养基。例如，马铃薯块、胡萝卜条和米饭等。,（2）非可逆性固化培养基,Eg.血清培养基或无机硅胶（silica gel）培养基等，其中的硅胶平板是专门用于化能自养细菌的分离、纯化等。,指一类一旦凝固后不能在重新融化的固化培养基。,（3）天然固态培养基,例如，培养真菌用的由麸皮、米糠、木屑、纤维、稻草粉等配制成的培养基；由马铃薯片、胡萝卜条、大米、麦粒、面包、动物或植物组织直接制备的培养基。,由天然固态基质直接配制成的培养基。,（4）滤膜（membrane filter）,是一种坚韧且带有无数微孔的醋酸纤维薄膜。若把滤膜制成圆片覆盖在营养琼脂或浸有营养液的纤
25、维素衬垫上，就形成了具有固体培养基性质的培养条件。,滤膜主要用于对含菌量很少的水中微生物的过滤、浓缩，然后揭下滤膜，把它放在含适当营养液的衬垫上进行培养，待长出菌落后，可计算出单位水样中的实际含菌量。,1.基础培养基（minimum media）,在一定条件下含有某类微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基，也称为基本培养基。,2.加富培养基（enriched media）,在普通培养基（如肉汤蛋白胨培养基）中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基。用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物。,Eg.培养百日咳博德氏菌（Bordetella pertussis）需要含有血液的加富培养基。,
26、这些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等。,根据待分离微生物的特点设计的培养基，用于从环境中富集和分离某种微生物。（目的微生物在这种培养基中较其他微生物生长速度快，并逐渐富集而占优势，从而容易达到分离该种微生物的目的。）,3.增殖培养基（complete media）,在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其他微生物，这种培养基称为增殖培养基。常用于菌种筛选。,Eg.要分离出能利用石蜡油进行发酵的酵母菌，只需在配方里使用石蜡油作碳源。,4.选择性培养基（selected media）,一类根据某微生物的特殊营养要求或其对某化学、物
27、理因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能，广泛用于菌种筛选等领域。,选择性培养基是19世纪荷兰的M.W.Beijerinck和俄国的S.N.Vinogradsky发明的。,例如，在培养基中加入链霉素、氯霉素可以抑制原核微生物的生长，这种培养基用于分离真菌。,（1）利用该分离对象对某种营养物有一特殊“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物，把它制成一种加富性选择培养基（enriched selected media），采用了这类“投其所好”的策略，就可使原先极少量的筛选对象很快在数量上接近或超过原试样中其他占优势的微生物，从而达到了富集或增殖（enrichment）
28、的目的。,作为加富的营养物主要是一些特殊的碳源或氮源，例如，甘露醇可富集自生固氮菌；纤维素可富集纤维分解菌；石蜡油可富集分解石油的微生物；较浓的糖液可富集酵母菌。,（2）利用该分离对象对某种抑菌物质所特有的抗性，在筛选培养基中加入这种抑菌物质，经培养后，使原有试样中对此抑制剂表现敏感的优势菌生长大受抑制，原先处于劣势的分离对象大量增殖，最终在数量上占优势。通过这种“取其所抗”的办法也可达到富集培养的目的。这种培养基称为抑制性选择培养基（inhibited selected media）。,用作抑制它种微生物的选择性抑菌剂有染料（结晶紫等）、抗生素、脱氧胆酸钠和叠氮化钠等。,用于选择性的其他理化
29、因素还有温度、氧、pH和渗透压等。,在实际应用中，所设计的选择性培养基几乎都同时利用了以上的“投其所好”和“取其所抗”两种功能，可充分提高其选择效率。,5.鉴别性培养基（differential media）,一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只需肉眼辨别颜色就能方便的从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。,用于鉴别不同类型微生物的培养基特定的化学反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变化,可将该种微生物与其他微生物区分开来。,最常见的鉴别性培养基是伊红美蓝乳糖培养基，即EMB（Eosin Methylene Blue）培养基。它在饮用水、牛奶的大肠菌群（
30、coliforms）数等细菌学检查和在 E.coli 的遗传学研究工作中有着重要的用途。,EMB培养基中的伊红和美蓝两种苯胺染料可抑制G+细菌和一些难培养的G细菌。在低酸度时，这二种染料结合形成沉淀，起着产酸指示剂的作用。试样中的多种肠道菌会在EMB培养基上产生易于用肉眼识别的多种特征性菌落，因而易于辨。例如 E.coli 强烈分解乳糖而产生大量的混合酸，菌体呈酸性，菌落被染成深紫色，从菌落表面的反射光中还可看到绿色金属闪光（似金龟子色）。,1.配料,在容器中加入少量水,按照配方正确称取各种药品（依次加入）,自然水,蒸馏水,加足所需水量,2.溶解,加热溶解，特别是加有琼脂的培养基，一定要煮沸，
31、琼脂的熔解温度9597，且需要边加热边搅拌以防止烧焦。,3.调pH,用1N的盐酸或的1N NaOH把培养基调节到所要求的值。,4.过滤,滤纸或棉花进行过滤。,5.分装,一般培养基放在三角瓶或试管中灭菌使用,若作静置培养，则100 ml培养基250 ml的三角瓶，最多不能超过150 ml培养基250 ml的三角瓶，否则灭菌时培养基沸腾容易污染棉塞，造成染菌；若作摇瓶培养，则1520 ml培养基250 ml的三角瓶，保证通气良好。,（1）三角瓶,液体培养基一般装45 ml，约试管的14高度；固体斜面培养基一般装34 ml，约试管的15高度。,（2）试管分装,6.包扎,分装好后，塞上棉塞，在用牛皮纸将棉塞包裹好，防止灭菌时水份进入把棉塞弄湿。,7.灭菌,按配方上要求的温度、压力进行高压蒸汽灭菌。如果灭菌的温度太高，营养成分会被破坏，培养基中的糖、氨基酸会使培养基的颜色变深。,8.摆斜面,灭菌后需要摆斜面的试管要趁热斜着摆放，使其凝固成为一个斜面，约占试管长度的12。,9.贮存,培养基在30下放置一天，无污染的即可使用。一般用牛皮纸包裹好存放于4冰箱中备用。,
