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1、第四章 园艺植物种质资源离体保存与无性系变异筛选,第一节 园艺植物种质资源的离体保存 种质保存（germplasm conservation）是指利用天然或人工创造的适宜环境保存种质资源，使个体中所含遗传物质保持其遗传的完整性和较高的活力，并能通过繁殖将其遗传性传递下去。,种质资源保存,常规的种质资源保存的方法,1965年Henshaw和Morel首次提出germplasm conservation in vitro；1982年国际植物遗传资源委员会专门成立了离体保存咨询委员会(advise committee on in vitro storage)。,种质资源离体保存（germplasm
2、conservation in vitro）：限制生长保存和超低温保存,一、限制生长保存 限制生长保存（restricting conservation）是指改变培养物生长的外界环境条件，限制离体保存材料的生长速度，使细胞生长降至最小限度，但不死亡，从而达到延长继代培养时间的目的。目前使用较多的限制细胞生长的措施有改变培养环境（如降低培养温度、减少培养瓶内氧气含量、减少光照等）、提高培养基渗透压、加入生长抑制剂、饥饿法、失水干燥保存等。,低温保存 低温保存又称微生长保存或最小生长法，是利用植物生命活动随着温度的降低而减弱甚至几乎完全停止的原理，将外植体在低温条件下，结合其他不适合生长的环境条件
3、，从而抑制或延缓离体培养物的生长和发育，延长寿命、达到种质保存的目的。低温保存种质常用温度范围有3种：常温（20 5）、常低温（015）、低温（-800）。低温保存是种质资源短期和中期保存常用的方法。主要适用再生植株、分生组织培养物的保存,2.干燥保存 将愈伤组织或体细胞胚等培养物，适当干燥失水，移入适宜的低温下，可成功保存种质。（1）预处理：将蔗糖浓度增至0.15mol/L或更高，预处理12-20d。（2）干燥：包括胶囊化处理（encapasulation treatment）和脱水处理（desiccation treatment）等方法。（3）储藏：通常选用0以上低温，或室温储藏。,3.生
4、长抑制保存 采用生长抑制剂或生长延缓剂延缓培养物的生长，延长保存时间。如采用3mg/L的ABA使草莓试管苗在251的常温下保存12个月，存活率62.5%；延长5个月保存时间。在62保存15个月，存活率100%。常用生长延缓剂有ABA、多效唑（PP333）、矮壮素（CCC）和比久(B9)和生长抑制剂三碘苯甲酸（TIBA）、烯效唑（S-3307）和青鲜素（MH）等。,4.高渗透压保存 提高培养基渗透压可以一直培养材料的生长。如在培养基中添加渗透化合物，如高浓度蔗糖、甘露醇、山梨醇等。蔗糖浓度由3%提高到10%左右，可明显抑制培养物的生长。,二、超低温保存 超低温保存是指在-80至-196甚至更低温
5、度下进行生物材料的保存。在超低温环境下，植物活细胞的代谢和生长几乎完全停止，植物处于相对稳定的状态，但能保持正常的活性和形态发生能力，从而达到长期保存的目的，在适宜的条件下可迅速繁殖，再生出新的植株，并保持原来的遗传特性。,保持细胞培养物的遗传稳定性；2.长期保存植物的种质资源;长期保存农作物的优良品种及其育种亲本材料的种质；建立长期保存的茎尖分生组织种质库及无病毒的原种；5.保存实验材料，防止再培养中遗传变异。,超低温保存的作用及意义,（一）超低温保存的原理,在低于-800C的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。因此采取适当的方法将生物材料降至超低温，即可使生命活动固定
6、在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。,冷冻保存是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-800C的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。而复苏是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。,水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而
7、导致的细胞损伤称为细胞内冰晶损伤。,如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。,当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质
8、损伤，细胞得以在超低温条件下保存。,在复苏时，一般以很快的速度升温，1-2分钟内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。而且不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。,1.主要仪器设备(1)用于组织和细胞培养的全套设备；(2)普通冰箱；(3)-70-80的超低温冰箱；(4)程序降温仪；,（二）超低温保存的基本设备和程序,(5)玻璃或塑料试管（5ml 或10 m1），封盖严密，不进液氮；(6)液氮;(7)光学
9、显微镜和紫外荧光显微镜；(8)分光光度计。,2.基本程序(1)材料的准备与选择。(2)预处理。(3)将材料装入试管，并随即插入冰浴中。(4)加入0预冷的冰保护剂，在0(冰浴中)放置30一45分钟。(5)降温冰冻。,(6)保存后的化冻：一般在3740 温水浴中快速化冻。(7)活力测定,通常采用TTC法(氯化三苯四氮唑还原法)。如果是单细胞或原生质体，可采用活性荧光素染色法，显示活细胞，统计存活率。(8)再培养，观察组织细胞恢复生长的速度、存活率、植株的再生能力。(9)遗传性状的分析：如植株的形态特征、生长发育状况、染色体、同工酶及抗逆性等。,1材料的特性；植物的种子、茎尖、花粉、胚状体、愈伤组织
10、、悬浮细胞、原生质体等均可用于超低温保存。但基因型、抗冻性、器官组织和细胞年龄、生理状态影响存活率。具有丰富稠密、未液泡化的细胞质，细胞壁薄，体积小，分裂相细胞比例高，细胞内自由水含量低的细胞适宜超低温保存。2预处理 目的：A.增加细胞分裂和同步化；B.减少细胞内自由水的含量；C.增强细胞的抗寒性。,（三）影响超低温保存效果的主要因素,预处理方法：(1)继代培养:细胞、组织继代培养中细胞分裂分化同步化的调控，增加指数生长期细胞。(2)预培养:增加培养基中的糖浓度，提高渗透压；或在预培养基中加入诱导抗寒力的物质或冰冻保护剂，如脱落酸(ABA)，山梨糖醇、脯氨酸及二甲基亚砜(DMSO)等。(3)低
11、温锻炼：如香石竹茎尖经4低温预处理14天，不仅提高了存活率而且分化率从30增加到60。,3冰冻保护剂 迄今，已经报道了多种类型的冰冻保护剂。分为渗透性和非渗透性冰冻保护剂。前者如二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇、乙酰胺等，后者有蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮（PVP)等。但作为冰冻保护剂的物质应该具备以下特性：（1）易溶于水；（2）在适当浓度下对细胞无毒；（3）化冻后容易从组织细胞中去除。,冷冻保护剂的作用：(1)降低冰点，促进过冷却和“玻璃态化”的形成；(2)提高溶液的粘滞性，阻止冰晶的生长，(3)DMSO可使膜物质分子重新分布，增加细胞膜的透性，在温度降低时，加速细胞
12、内的水流到细胞外结冰，防止细胞内结冰的伤害；(4)稳定细胞内的大分子结构，特别是膜结构，阻止低温伤害，非透性保护剂的主要作用在质膜上。,4降温冰冻方法(1)快速冰冻法：将材料从0，或者其他预处理温度(如木本植物的冬芽在-3-10预处理20天)直接投入液氮。其降温速度在每分钟l000以上。适合高度脱水的材料，如种子、花粉、冬芽等。植物体内的水分在降温冰冻过程中，从-10到-140是冰晶形成和增长的危险温度区，在-140以下，冰晶不再增生。因此，快速冰冻法成功的关键在于，利用超速冷冻，使细胞内的水分迅速通过冰晶生长的危险温度区，即细胞内的水分还未来得及形成冰晶中心，就降到了-196的安全温度，从而
13、避免了细胞内结冰的危险。,(2)慢速冰冻法：通常成熟的植物细胞都具有大的液泡，含有大量水分。对大多数植物材料说来，不适宜采用快速冰冻法，而需要在冰冻保护剂存在的条件下，采用慢速冰冻法。以每分钟0.1-10的降温速度(一般12分较好)。降到-70左右，随即浸入液氮，或者以此种速度连续降到-196。在这种降温速度下，可以使细胞内的水分有充足的时间不断流到细胞外结冰，从而使细胞内的水分减少到最低限度，达到良好的脱水效应，避免细胞内结冰。该方法适用于成熟含有大液泡和含水量高的细胞。,(3)两步冰冻法：这种方法是慢冻法和快冻法的结合，或者说，是一种改良的慢冻法。第一步是用慢速降温法从0降到一定的预冻温度
14、，并停留一段时间，使细胞达到适当的保护性脱水；第二步，投入液氮中迅速冰冻。,(4)逐级冰冻法：此方法是制备不同等级温度的冰浴，如-10，-15，-23，-35，或-40等。保存材料经冰冻保护剂在0预处理后，逐步通过这些温度，样品在每级温度上停留一定时间(46分钟)，然后浸入液氮。,5.冷冻保存：超低温保存的冷源有干冰（-79）、超低温冰箱（-80-150），液氮蒸汽相（-140）和液氮（-196）等，以液氮最为常用。,6解冻方法 实验证据证实，植物的冻害常发生在冰凉和化冻两个过程。因此要使植物种质的超低温保存获得成功，不仅要求有一个合适的降温冰冻程序，而且还要求采取合适的解冻方法，以避免在解冻
15、过程中产生细胞内的次生结冰，并应防止在解冻吸水过程中水的渗透冲击对细胞膜体系的破坏。,通常采用快速解冻方法，即将液氮保存后的材料在37-40的温水浴中化冻。因为超低温冰冻材料化冻时，再次结冰的危险温度区域大约是-50至-10。从理论上说，借助迅速的化冻速度通过此温度区，从而避免细胞内次生结冰。慢速解冻是将液氮中保存的材料先置于0 低温下解冻，再逐级升至室温下进行解冻慢速解冻可以使水分缓慢深入细胞，避免因强烈渗透而造成水分对细胞膜的破坏，适合含水量较少的材料，如木本植物的冬芽。,7再培养：指已解冻的材料重新置于培养基上使其恢复生长的过程。再培养是检验冷冻保存效果或确定保存方法是否适合的最根本方法
16、。黑暗条件下有利于超低温保存培养物的恢复生长。,显示细跑活力的TTC法(氯化三苯四氮唑还原法)，反映脱氢酶活力。2显示细胞存活率的二醋酸酯荧光素(FDA)染色法，反映酯酶的脱脂化作用，或采用中性红染色法。3.再培养 新鲜培养基上培养。存在停滞期。,（四）超低温保存后细胞活力、存活率及遗传特性的观测,4.遗传性状的分析：1)细胞全能性的保持：形态发生能力的表达情况。2)后代的形态特征及生长发育状况。3)后代染色体的分析。4)同工酶谱的分析。5)特殊产物的分析。6)抗逆性的分析。,芽及茎尖分生组织的超低温保存,1、茎尖超低温保存植物种类：,2.茎尖分生组织的超低温保存程序（基于保护性脱水）：（1）
17、种子消毒灭菌，种子经70酒精迅速漂洗，10漂白粉溶液消毒20分钟，无菌水洗涤4次(2)在无菌条件下播种于具润湿滤纸的灭菌培养瓶或培养皿内。置于2528培养箱中黑暗培养。(3)萌发生长45天后，在无菌条件下切取茎尖的分生组织，0.3一0.5mm长，第1对叶原基。在实体解副镜下进行操作。(4)将切取的茎尖分生组织接种于固体B5培养基上，内含0.5pmolL BA及5%DMSO，光照16小时，温度2015预培养48小时。(5)预培养后，将培养瓶浸入冰浴中2小时。(6)将茎尖分生组织转移到在冰浴中预冷的具有1m1液体B5培养基的离心管中。,(7)逐步加入等体积的预冷的10DMSO，在30分钟内加完，使
18、DMSO的最终浓度为5%，然后再放置10一30分钟(8)密封离心管口，以每分钟降低0.6的速度慢速降温到40，然后浸入液氮中(196)。(9)在液氮中贮存定时期后，取出材料在27水浴中迅速化冻。化冻后立即将试管转移到冰浴中(10)用等体积B5培养基在30分钟内，分6次逐步加入试管中。(11)吸去混合液，并用B 5培养基洗涤4次。然后将茎尖分生组织转移到固体B5分化培养基上。3周后可分化成苗。植株的再生率达70以上，已有的试验表明，贮存2年多仍能存活。,Sakai(1990)和Yamada(1991)建立了一种茎尖分生组织的超低温保存简便方法，即玻璃化超低温保存，该技术的关键是，在冰冻前，采用高
19、浓度的冰冻保护剂使保存材料脱水，以致不需要慢速程序降温，从室温直接浸入液氯，即可获得很高的存活率。玻璃化超低温保存的优点：（1）不需要昂贵的程序降温仪；（2）避免细胞内外冰晶的形成；（3）适合各种外植体。,基于玻璃化处理结合快速降温的超低温保存方法：（1）玻璃化法：是指冰冻保护剂对材料进行预处理后，再用高浓度的玻璃化保护剂进行脱水处理，然后快速投入液氮保存。基本程序：材料选择-预处理-装载-玻璃化保护剂脱水处理-液氮保存-解冻和洗涤-活性检测和恢复培养。（2）包埋-脱水法：将包含样品的海藻酸钠溶液滴入高钙溶液，固化成球状颗粒，同时辅以高浓度蔗糖预处理样品，使样品获得高抗冻力和抗脱水力。基本程序
20、：材料选择-海藻酸钠包埋样品-高浓度蔗糖预培养-无菌培养或硅胶中进行干燥脱水-立即投入液氮-快速化冻-活性检测。,（3）包埋-玻璃化法：综合了璃化法和包埋脱水法的优点而建立的方法。区别是在脱水处理时用玻璃化溶液代替干燥过程，然后使包埋珠和玻璃化溶液一同进入玻璃化。易于操作，脱水时间短，能同时处理大量材料，存活率高。是茎尖分生组织保存的理想方法。基本程序：材料选择-预处理-海藻酸钙包埋-玻璃化溶液处理-液氮保存-快速解冻-恢复培养。（4）干燥冷冻法：快速冷冻保存的方法，将样品在含有高浓度渗透化合物的培养基上培养一段时间，或者经硅胶、无菌空气干燥脱水数小时，或者用海藻酸钙液包埋样品，无菌风进一步干
21、燥，然后投入到液氮中保存。,（5）预培养法：将保存材料在含有低温保护剂的培养基上预培养一段时间以诱导脱水，然后投入到液氮中保存，常用高浓度蔗糖预培养，另外在含有PEG和DMSO的培养基上对材料进行预培养也可以提高保存存活率。（6）预培养干燥法：是与培养法和干燥法的结合，材料现在含有低温保护剂的培养基上预培养并进行干燥，然后投入到液氮中保存。,茎尖分生组织玻璃化法超低温保存程序：(1)从试管苗中切取茎尖分生组织。(2)在含1.2 mo1L 山梨糖醇的B5培养基上4预培养2天。(3)将预培养后分生组织放入试管，然后加入高浓度的冰冻保护剂PVS2。即在含0.4 mo1 L 蔗糖的B5培养基中溶解30(wv)甘油，15(Wv)乙二醇和15(wV)DMSO，在25停留5分钟，或者在0停留15分钟，期间更换2次溶液。(4)直接浸入液氮保存。,(5)贮存一定时间后，在25 水浴中快速化冻，为280 分。(6)化冻后，倒出保护剂，将材料放入含1.2 moIL蔗糖的B5培养基中，2510分钟。(7)转移到固体B 5培养基上的灭菌滤纸上。1天后，再转移到新鲜的同样培养基滤纸上，25、l 4小时光照下培养。3天内恢复生长，3周后产生成苗，成苗率(存活率)达8090。该方法也适用于愈伤组织及悬浮培养细胞。,2013年4月2日,
