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1、第六章 基因定位与遗传图的制作第三节 人类基因定位的基本方法,一、人类基因定位和作图1、人类基因定位常用方法(1)家系分析定位（Pedigree method)(2)体细胞杂交定位(3)原位杂交定位（in situ hybridization)(4)基因剂量效应法(5)染色体畸变定位(6)限性酶精确分析定位2、人类基因组作图有四种图谱：遗传图或遗传连锁图；物理图；核苷酸图；基因图。所有的图都需要有作图的界标（landmark）或遗传标记（genetic marker）。,常用的遗传标记有各种血型、各种蛋白质的电泳行为、蛋白质的氨基酸组成、等位基因和特定的DNA序列等。遗传标记是指可以追踪染色体
2、、染色体的某一片段、某个基因或某一特定DNA序列在家系中传递轨迹的任何一种遗传特性。遗传标记常用于基因的连锁分析、基因定位、遗传作图和基因转移的鉴定等。DNA序列多态性（DNA sequence polymorphism）。指同一物种的不同个体基因组DNA等位序列之间的差异。包括长度多态、限制性酶切位点多态以及单核苷酸多态等,实质上是DNA序列的突变所造成的核苷酸排列顺序的差异性。基因组指纹图（genome fingerprinting map）。用短串联重复序列探针与经限制性内切酶完全酶切的基因组DNA杂交，电泳后显现的杂交条带图谱。重复(DNA)序列(repetitive DNA sequ
3、ence).指DNA分子中重复出现的核苷酸序列.分低度重复序列(基因组中有2-10个长度为1到几个bp的拷贝的DNA序列);中度重复序列(基因组中有10到几千个平均长度约300bp的拷贝);高度重复序列(基因组中有数千个到几百万个长度为6-200bp的拷贝).,3、基因作图中常用的遗传标记或界标：(1)限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）。指用同一种限制性内切酶切割不同个体的基因组DNA时，会产生长度不同的DNA片段，这反映出不同个体来源的DNA序列有差别。当这种DNA多态性序列与人类某种遗传疾病的基因连锁时，可作为
4、遗传病诊断的标记。(2)数量可变串联重复序列（variable number of tandem repeat，VNTR）。在基因组中广泛分布着单位长度为612个核苷酸的串联重复序列，在DNA的某些位置上这种串联成簇的重复单位数目不同，用在串联重复序列两侧切割的限制性内切酶酶切后，就会产生重复单位数目不等的片段。这种数量可变串联重复序列的片段长度不同，可作为DNA多态性标记。,(3)短串联重复序列（short tandem repeat，STR）。STR的重复单元长度为26个核苷酸，经1060次串联重复而成的简单重复序列。在不同个体的基因组中，这种重复单元的数目变异很大，比RFLP和VNTR有
5、更高的多态性，便于用PCR检测，可大大提高遗传制图的精度。(4)单核苷酸多态（single nucleotide polymorphism，SNP）。指同一物种不同个体基因组DNA的等位序列上单个核苷酸存在两种不同的核苷酸且出现频率大于1%2%的现象。SNP作为单碱基的置换，在群体中只有两种等位基因型可以检出，就形成双等位标记（bialledic marker）。这种界标在人基因组中可多达300万个，平均每1300bp就会有一个，即两个人的基因组作比较时，平均每1300个核苷酸中就有1个差别，所以这种界标数目极多，覆盖密度大，可大大提高基因组作图的精度。SNP作为一种碱基的置换，大多数是转换（
6、即两种嘌呤间和两种嘧啶间,的置换）。它与点突变的区别是点突变率低于1%2%。SNP可分为分布在基因组非编码序列中和基因组编码序列中(称为cSNP)。(5)序列标签位点（sequence tagged site，STS）。是人类基因组中已知的、非多态性的、单拷贝的短单一序列，长度为200500bp。这种界标可直接标定在基因组上，便于用PCR进行扩增和检测。人类的Y染色体已经得到高分辨率的STS图谱。(6)表达序列标签（expressed sequence tag，EST）。为一种非多态的短单一序列，长度一般在150400bp,来自cDNA文库的表达序列，代表基因表达信息的cDNA序列片段，即ES
7、T是代表一种cDNA分子（基因），但一种cDNA分子或一个基因可以有不止一个EST。由EST构成的图谱，有助于构建转录图或基因图。,(7)随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA,RAPD）。用同一套PCR随机引物（通常每个引物为10个核苷酸左右）去扩增群体中不同个体的基因组DNA，得到大小和数量有差异的产物。这些扩增产物（DNA片段）多态性可以反映基因组相应区域的DNA多态性。(8)扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）。AFLP标记是RFLP和RAPD相结合的产物，是用PCR
8、技术在体外扩增DNA时出现的片段和长度多态性现象，其原理是选择性地扩增基因组DNA限制性内切酶切片段。AFLP扩增可获得在某一品种出现而在另一品种不出现的特定的DNA谱带。,4.人类基因组作图及图谱（1）遗传图（genetic map）,即连锁图（linkage map）。是以多态的遗传标记为界标，通过计算细胞减数分裂过程中，同源染色体间交换导致遗传标记之间发生重组的频率，来确定两个标记在染色体上的相对位置。遗传标记之间的相对距离以厘摩（cM）为单位，重组值1%为1cM.如果是利用染色体缺失、倒位、易位等畸变所得的结果，将基因位点或遗传标记排列成直线序列，称为细胞遗传图(cytogenerti
9、c map)。（2）物理图（phsical map）。以特定的DNA序列为界标直接排列在基因组DNA分子上，这些特定的DNA序列可以是多态的，但主要是非多态的。图上界标的距离以物理长度表示，即以核苷酸对的数目来表示，如Kb（Kliobase，千碱基对）、bp（碱基对）等。,物理图上的绝对距离即物理长度也可换算成遗传图上的图距（cM）。不同物种的换算值不尽相同，如人类基因组遗传图上的1cM相当于约1000kb（即100万碱基对：Mb），小鼠则相当于约1700kb。水稻遗传图上1cM相当于250kb，高粱遗传图1cM约相当于450kb。物理图通常以限制性内切酶识别的酶切部位为DNA标记，应用多个常
10、用内切酶，可制作精细限制图。（3）DNA序列图。在物理图作图法基础上，应用DNA测序方法，先测定每个小片段的DNA序列，然后叠连拼接成大片段，尽可能地减少和缩小空当（gap），最后制成基因组的全序列图。测序的方法分手工测序和自动测序。手工测序有双脱氧法（dideoxy technique）或称链终止法（chain terminator techniques），又称Sanger法（英国科学家）。DNA化学测序法又称MaxamGilbert法，还有PCR测序法等。自动测序则有各种型号的自动测序仪。,（4）基因图。这是将基因精确定位在序列图上制作成基因图。每个基因的长度不同，包含的内含子和外显子的数
11、目也不同。根据人类基因组测序草图结果，在人类基因组中的约4万个基因中，基因功能未知的基因占59%，已有诠释的基因数目约2.6万个。基因数目最多的是19号染色体（23个基因/Mb），基因数目最少的是13号染色体和Y染色体（5个基因/Mb）。如前所述，解释和理解由A、T、C、G代表的人类DNA序列信息和基因的功能将需要几十年的时间。二、人类基因定位的几种基本方法1.家系分析法（pedigree method）家系也称“家谱”或“系谱”，是指一个家族各世代成员数目、亲缘关系、特定基因和遗传标记在该家族内的传递、表达和分布的记载。家系分析是指分析家系中各成员的表型来推断某一性状或某一疾病在该家系中的遗
12、传方式。,(1)Y染色体连锁基因定位；(2)X连锁基因的定位；(3)常染色体基因定位.2.基因剂量效应法：人类第2号染色体短臂缺失（2P-）使细胞酸性磷酸酶（ACP-1）活性降低；先天愚型（21三体）的SOD酶活性为正常人的1.5倍。3.染色体缺失定位法 利用染色体末端缺失检测细胞内某些基因产物存在与否。4.体细胞杂交定位法 如人、鼠细胞杂交形成杂种细胞系，进行人的基因定位（图4-19；表4-5）。细胞促融因子有仙台病毒(sendaivirus)和聚乙二醇(polyethlene glycol,PEG).5.核酸杂交技术(1)克隆基因定位法（表4-6).限制性内切核酸酶.(2)原位杂交法（图4
13、-20）.探针(probe).(3)原位PCR（in situ PCR）法,第四节 DNA 分子标记技术一、遗传标记方法主要有4种类型:形态标记（morphological markers）细胞学标记（cytological markers）生化标记（biochemical markers）分子标记（molecular markers）1.形态标记：是以生物的外部特征，如株高、穗长、花色、粒重等宏观性状作为遗传研究的标志。可靠性较低，应用有较大局限性。2.细胞学标记：指以染色体的核型、显带（C带、G带、R带、T带等）作为遗传研究的标记。3.生化标记：主要指以同工酶活性、酶带等作为遗传分析标记。
14、4.分子标记：广义的分子标记是指可遗传并可检测的特异DNA序列、RNA或蛋白质；狭义的分子标记仅指DNA（或RNA）标记。,二、基于Southern杂交技术的分子标记1.分子杂交（molecular hybridization）2.印迹（blotting）3.Southern杂交和Northern杂交(图5-7）Southern杂交是指DNA/DNA分子杂交；Northern杂交是指DNA/RNA杂交，二者的方法大致相似。Southern杂交主要用于制作染色体的物理图谱、限制性片段长度多态性、转基因生物的分子鉴定等。Northern杂交可以用于检测某基因表达的时空特异性。测定细胞的总RNA或m
15、RNA.转移蛋白质分子用于杂交的方法称为Western杂交，至今还没有Eastern杂交这一技术。4.限制性片段长度多态性（RFLP）分析5.数量可变串联重复（VNTR),三、随机（或半随机）引物分子标记技术（以PCR为基础的 分子标记）1.随机扩增多态性DNA(RAPD)2.AFLP指纹技术。又称专一扩增多态性（specific amplified polymorphism，SAP）。本节参考文献:1.郑成木 主编.植物分子标记原理与方法。长沙：湖南科学技术出版社，2003.2.曹仪植 主编.植物分子生物学。北京：高等教育出版社，2002.3.顾红雅、瞿礼嘉、明小天、陈章良编著.植物基因与分子操作。北京：北京大学出版社，1995.,
