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1、第十二单元,移植免疫学检测,实验一 HLA微量淋巴细胞毒试验,微量淋巴细胞毒试验（Microcytotoxicity assay）是在经典的补体依赖的淋巴细胞毒试验（complement dependent cytotoxicity，CDC）基础上发展而来的一项实验技术，目前已经广泛应用于器官移植供、受者间的交叉配型、复发性流产的封闭抗体检测等多个领域。在器官移植的文献中提及的CDC法多指微量淋巴细胞毒法。,微量淋巴细胞毒试验概念,器械 微量淋巴细胞毒反应板（泰萨奇板）、倒置荧光显微镜、微量移液器、吸管、温箱、离心机、磁架等。试剂 淋巴细胞分离液(Ficoll,1.077)、T/B淋巴细胞分离
2、磁珠及洗涤液、冻干补体、荧光染色液、供者全血23ml（EDTA或ACD抗凝）、受者血清2ml、阴性对照血清（可用1640培养液或PBS替代）、阳性对照血清（抗全淋 巴细胞抗体ALG/ATG）。,实验器材和材料,淋巴细胞的分离（Ficoll法）：1.将供者全血用PBS(pH7.4)缓冲液 按1:1稀释，混匀备用；2.取15ml离心管一支，加入一定体积的Ficoll液，用吸取稀释后的供者全血，沿试管壁缓慢加入，使全血置于Ficoll上层。Ficoll液与稀释后的全血体积之比为1:2；3.15002000rpm/min（半径15cm水平转子）离心10min；4.取出离心管，吸取中间白膜层，置于另一干
3、净离心管中；5.加入PBS，洗涤；6.2000rpm/min离心5min，倾出上清液；7.重复步骤5、6；8.PBS液调整细胞浓度为2109/L。,实验方法,淋巴细胞毒反应（一步法）1.于泰萨奇板每孔中加入5l石蜡油，以防反应物挥发；2.建立反应格局，每位待测标本均应设立阴性对照、阳性对照；3.分别于各相应孔中加入1l淋巴细胞（混合淋巴细胞、T淋巴细胞、淋巴细胞）、1l待测血清以及2l补体；4.2225温度下孵育1h；5.荧光染色液染色并终止反应。,结果应在染色后10分钟内观察，以防荧光猝灭。特殊情况不能立即观察时，应将反应板用避光纸包紧，置于4冰箱中，尽早观察结果。死亡细胞由于荧光染料进入而
4、呈红色（染料中的EB与DNA结合），体积略为增大。活细胞因为细胞膜完整而呈明亮的绿色（染料中的CFDA与细胞膜蛋白结合），具有强折光性。,结果观察,根据死亡细胞占全部细胞的百分比来计分，目前普遍采用国际通用的NIH计分方法，如下表。判断死细胞的百分比需要操作者具备一定的工作经验，大致原则为：可疑2分，30为4，过半记6，强阳写8。,结果判断,淋巴细胞毒试验记分标准,1.每份标本都必须设立阴、阳性对照；2.温度过低有可能产生假阴性结果；3.只有当阴性和阳性对照结果准确时，该实验的阳性和阴性结果方能成立。,注意事项,淋巴细胞毒试验是测定患者机体内是否含有特异性针对供者的淋巴细胞毒抗体，检测的是HL
5、A特异性的IgG和IgM抗体，包括HLA-I类抗体和II类抗体。由于混合淋巴细胞中主要为T淋巴细胞，B淋巴细胞数量较少，而HLA-II类抗体在T淋巴细胞表面不表达，仅在B淋巴细胞表面表达，因而，利用混合淋巴细胞进行CDC试验时，对HLA-I类抗体阴性、II类抗体阳性的患者，易产生漏检，而造成这种结果的原因是由于混合淋巴细胞中B淋巴细胞占全部细胞的比例较少所致。为了更加真实、全面地反应患者的免疫状态，我们应该如何改善上述局限性对实验结 果造成的影响？,南方医科大学 裘宇容,实验讨论,实验二 群体反应性抗体检测,群体反应抗体（Pannel reactive antibody）是指存在于某些人体内的
6、抗人类白细胞(HLA)抗体，可通过输血、输血小板、妊娠以及器官移植等免疫途径获得。PRA测定即是检测患者体内是否存在HLA抗体、抗体的水平高低以及抗体特异性如何。PRA对于患者是否发生排斥、移植物的存活状态以及器官功能的实现都有着不可忽视的作用。,群体反应性抗体的概念,实验原理,将涵盖不同地域、不同人种的HLA-I类和II类纯化IgG抗原预先包被于泰萨奇微孔板中，与待测、血清反应，再加入碱性磷酸酶标记的二抗，孵育后加入酶作用底物，待显色反应完成后终止反应。如果待测血清中存在HLA-I类抗体，则相应的HLA-I类混合抗原孔中会发生特异性的抗原抗体反应，反应孔呈现蓝色的阳性反应结果；若无相应抗体，
7、则反应孔中为无色阴性结果。,器械：各种移液器、吸头、温箱、离心机、微量酶标仪等。试剂：抗原微孔板（以LAT mix tray为例）对照血清（10serum control）去离子水(sterile deionized water)酶标二抗（100alkaline phosphatase-conjugated anti-human IgG)抗体稀释液（1antibody diluent）洗液（10wash buffer）底物A和B（1colorimetric enzyme substrate A&B）反应终止液（1stop reagent）,实验器材和材料,试剂准备1.在第一次使用时，至少提前2
8、0min取出冻干对照血清以2ml去离子水轻轻摇震使其彻底溶解。将溶解后的对照血清溶液分装，每管100l，储存在-20冰箱中，每次实验前取出，恢复至室温后使用；2.将洗液用去离子水(sterile deionized water)按1：9稀释，可根据工作频率一次性配制一定量的工作液，4冰箱贮存备用；3.将待测标本用抗体稀释液（antibody diluent)按1：2稀释，约60l/test；4.酶标二抗（alkaline phosphatase-conjugated anti-human IgG)在第一次洗涤之前用抗体稀释液按1：100稀释，50l/test；5.底物A、B(colorimet
9、ric enzyme substrate A&B)在第二次洗涤之前按1：1比例混匀，50l/test。,实验方法,酶联免疫吸附反应1.根据反应格局表，将待测血清和各种对照品加入相应的孔中，每孔10l（阴性对照孔加入抗体稀释液，阳性对照孔和质控孔加入对照血清）；2.盖好反应板，2225孵育60min；3.用力将反应板中的血清甩出，并在垫有纸巾的实验台面上叩击反应板两至三次，在加入下一液体前，请注意加盖，保持反应孔湿润；4.于每孔中加入洗液(wash buffer)20-30l，轻轻晃动反应板，甩出洗液，叩击反应板两至三次；5.再重复步骤9两次；6.加入10ul酶标二抗，轻轻晃动反应板,2225孵
10、育40min；7.重复步骤9三次；8.每孔加入10l混合好的底物，37避光孵育1015min（一般不要超过15min）；9.待质控孔和阳性对照变成深蓝色后,每孔加入5l 终止液(stop reagent)，盖上反应板，15分钟后观察结果。,肉眼观察反应结果，蓝色或深蓝色为阳性,无色为阴性，阳性结果的颜色深浅程度与待测标本HLA抗体水平的高低成正比。有条件时可在微量酶标仪上读取吸光度值，并根据阴、阳性对照的吸光度值判定标本的阴、阳性。尽量在显色终止反应后1小时内读取反应结果，上机前请移去反应板盖。如因特殊情况需延迟观察结果时，请将反应板贮存于25冰箱中，此情况下可能会引起反应孔吸光度值降低，产生
11、假阴性结果。,观察结果,注意事项,洗涤 洗涤是ELISA实验中关键的步骤，如洗涤不充分，则可能出现本底过高的现象；但洗涤过度，亦可能丢失一些阳性反应；温度 除二抗反应过程外，本实验以2225为宜，温度过高或过低都会对实验结果产生不同性质的干扰；对于强阳性标本，可加大稀释倍数后再进行检测；本实验的难点为阳性结果的评价和判断，因此，如果操作者具备丰富的HLA专业基础知识，将会大大提高本实验结果判断的可靠性和准确性。,结果评价标准1.依据实验条件不同，各实验室结果具有不同的波动范围；2.当空白对照、阴性对照、阳性对照以及质控孔的OD值均在试剂盒可接受范围时，说明实验结果准确可靠；3.肉眼判断结果时，
12、应根据反应孔的颜色深浅计分，计分方法同“微量淋巴细胞毒试验”，以0，2，4，6，8分来表示反应由弱至强的程度。4.对于HLA混合抗体检测，建议4分以上为阳性。对于2分结果的定义是本实验的难点，应结合患者机体免疫状态而定。,结果分析,Cut-off值的确定不同的HLA抗体检测试剂盒，可设置不同的调节Cut-off值，建议在HLA抗体初筛时适当下调Cut-off值；对于HLA抗体特异性及抗体水平的检测，可根据试剂盒类型（LAT1240/1288/1HD/240）相应上调Cut-off值。调节Cut-off值的计算：调节Cut-off（阳性孔均值空白均值）校正系数空白均值PRA值的计算 PRA阳性孔
13、数/总检测孔数100%,南方医科大学 裘宇容,如孔2A2E均为阳性，根据反应工作表格局，说明抗体特异性为抗HLA-A1抗体；如孔2A2E中有3孔强阳性，而2孔阴性，应该如何分析？,实验讨论,实验三 病例讨论,病历 患者吴xx,女性，39岁，汉族，广东省汕头籍，家住汕头市鲈岗镇，2007年5月18入院。主诉：尿检、肾功异常6年，加重半年。缘于2001年5月无明显诱因出现头晕，腰酸痛，在当地医院就诊，査尿常规提示尿蛋白（+），肾功异常（肌酐130umol/L左右），给予对症治疗（具体不详），症状缓解。此后病情平稳。监测肾功肌酐逐步上升，2006年9月为200umol/L,11月再次出现头晕，伴恶心
14、，呕吐，测肌酐达700umol/L,就诊于西安某医院，诊断“慢性肾功不全尿毒症期”，行左前臂内瘘术，术后内瘘栓塞。拟行肾移植术，但因无合适供体，回当地医院继续治疗。2007-5-15复查肌酐1400umol/L,为行肾移植术，就诊我院，门诊以“慢性肾功能不全尿毒症期”收入科。病程中精神、饮食一般。24小时尿量1400ml左右，大便正常，体重无明显变化。婚育史：患者23岁已婚，生有2子3女，流产1次,查体：体温 36.6 0C，脉搏80次/分，呼吸18次/分，血压150/100mmHg发育正常，营养中等，神志清楚，精神欠佳，慢性病容，贫血貌，全身皮肤、黏膜无黄染，全身浅表淋巴结未触及肿大。颈静脉
15、无怒张，颈动脉无异常搏动，未扪及包块，甲状腺不肿大，气管居中，颈软无抵抗。胸廓对称无畸形，无局限性隆起，双侧乳房对称，未扪及肿块。胸壁未见静脉曲张，胸式呼吸存在，节律规整，叩诊呈清音，肺肝界位于右锁骨中线第5肋间，双肺呼吸音清，未闻及干湿性罗音及胸膜摩擦音。心前区无隆起，心尖搏动不明显，未见异常搏动，心界不大，心率80次/分，律齐，各瓣膜听诊区未闻及病理性杂音，无心包摩擦音。腹平坦，腹肌软，全腹无压痛及反跳痛，未扪及包块，肝脾肋缘下未触及。肝脾及双肾区无叩击痛，移动性浊音阴性，肠鸣音正常35次/分。生理反射存在，病理反射未引出。专科检查:双侧肋脊角未见异常隆起，皮肤无红肿，双肾区平坦，未触及包
16、块，双侧肋脊点无明显压痛，双肾区无叩击痛，未闻及血管杂音。双侧输尿管行径无压痛点，耻骨上区无膨隆及压痛，膀胱叩诊空虚。,实验室检查：血常规：WBC 4.42G/L，NEU%68.5%，RBC 2.37G/L，HGB 60g/L，HCT 0.193,PLT 132G/L；血型：“B”型；血生化：BUN 25.4mmol/L，Cr 975umol/L,GLU 4.7mmol/L，K+3.51mmol/L，Ca22.13mmol/L，TG1.35mmol/L，Tco2 21.1mmol/L；肝功能转氨酶、胆红素结果正常；ALB 39.8g/L；自身抗体阴性；凝血四项基本正常；乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病
17、及结核相关检查均阴性；肿瘤标记物检查未见异常；尿常规：尿蛋白（+），尿白细胞（+），尿隐血（+）。PRA40。心电图：1.窦性心律，2.左室肥厚。胸片：心影增大，符合尿毒症性心肌病。腹部B超：1.双肾缩小，实质回声增强，左肾囊肿，2.右侧附件区囊性占位，建议定期复查，3.肝、胆、胰、脾未见明显异常。超声心动图：1.左房轻度增大，2.主动脉瓣反流（轻度），3.左室顺应性减低。胃镜：十二指肠球炎。,讨论 患者高PRA,肾移植术前、术后注意事项。患者出现高PRA的可能原因有哪些？等待移植的患者术前如果接受过输血治疗、或者前一次移植后因排斥而导致移植物失功以及女性患者曾经生育过孩子（妊娠），那么患者体
18、内的免疫系统有可能受到来自其他个体（同种异体）的人类白细胞抗原（HLA）分子刺激（致敏），导致患者的免疫系统产生针对同种异体HLA分子的特异性抗体，并释放到外周血液中，我们将这些抗体称为群体反应性抗体（Panel Reactive Antibody,PRA），简称为PRA。PRA阳性受者称为致敏受者，PRA40%的受者称为高致敏受者。患者生有2子3女，流产1次。这可能是高PRA的主要原因。高PRA患者的器官移植存在哪些危害？研究表明，PRA在实体器官（肾、心、肺、肝等）移植排斥反应中扮演了重要角色，不仅与肾移植超急性排斥反应密切相关，而且与移植物功能延迟、急性排斥、慢性排斥以及移植物存活率下降
19、也有关系。,PRA阳性患者在移植配型上应严格注意哪些问题？临床上对患者术前的PRA水平及抗体特异性应进行定期监测，并针对每一个患者体内的HLA抗体水平及特异性制定治疗方案。PRA已成为实体器官移植术前组织配型的常规和首选指标，越来越受到临床医生的重视与关注。对PRA阳性致敏受者术前必须进行严格的交叉配型（补体依赖性淋巴细胞毒试验，CDC），选择HLA相配程度高、能够避开抗体特异性所对应的HLA分子、CDC阴性的供体器官。从而避免超急性排斥反应，减少急性和慢性排斥反应，提高移植物存活率。肾移植患者术后用药方案有哪些？FK506血药浓度应保持在什么范围，可预防移植肾急性排斥反应？患者术后可应用生物
20、制剂如抗胸腺细胞球蛋白（ATG）免疫诱导治疗，术后使用三联免疫抑制剂普乐可复（FK506）骁悉（MMF）强的松，术后24周内，是肾移植成功的关键阶段，急性排斥反应大部分都发生在这一时期，为了加强预防移植肾急性排斥反应的效果，FK506血药浓度保持在10 12ng/ml。监测血药浓度2次/周，及时调整药物剂量，保持血药浓度在治疗窗范围。,肾移植术后患者由于免疫抑制剂的使用可致免疫功能低下而引发感染，为避免感染出现，实验室进行哪项检查可提示患者的免疫功能状态是否低下？目前免疫抑制药物缺乏特异性，对移植肾免疫反应的降低将伴随机体对感染和肿瘤免疫力的降低，高PRA患者由于生物制剂的使用及FK506血药浓度偏高，更易发生各种类型的感染，术后应注意观察感染症状的出现，注意免疫状态的监测。如CD4+/CD8+T细胞比值，CD4+和CD8+T细胞分别代表T辅助细胞和T抑制细胞亚群.CD4+/CD8+比值是重要的免疫状态监测指标。中国人正常值范围为0.981.94.在急排的病人中,该比值明显升高,可以协助诊断.若比值明显降低,提示机体处在过度抑制状态,免疫抑制剂用量过大,容易发生严重的感染。,南方医科大学 裘宇容,
