教学课件：第十五章β-内酰胺类抗生素2已.ppt

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1、第一节 概述第二节 青霉素第三节 头孢菌素第四节 其他重要的内酰胺类抗生素,第十五章 内酰胺类抗生素,抗生素是青霉素、链霉素、红霉素等一类化学物质的总称。是生物在生命活动过程中产生的，在低微浓度下有选择性地抑制或杀灭其他种生物机能的有机物质。具有抗菌、抗肿瘤、杀虫除草、抑制生物体中某些酶类的作用，有些还具有某些药理活性，如强力霉素镇咳；新霉素降胆固醇,抗生素概述,抗生素的生产方法生产主要采用微生物发酵法，属于次级代谢产物，少数如氯霉素、磷霉素亦可用化学合成法生产。,抗生素概述,半合成抗生素将生物合成法制得的抗生素用化学或生化方法引入特定的功能基团进行分子结构改造而制成各种衍生物增强抗菌力扩大抗

2、菌谱对耐药菌有效便于口服减低毒副作用改善药理性质、提高生物有效性,抗生素概述,抗生素的生物来源放线菌：链霉菌、诺卡氏菌属、小单孢菌属真菌：青霉菌属、头孢菌属、担子菌细菌：多粘杆菌、枯草杆菌、芽孢杆菌植物或动物：蒜蒜素；动物脏器鱼素,抗生素概述,抗生素化学结构的分类-内酰胺类：青霉素类、头孢菌素类，包含一个四元内酰胺环氨基糖苷类：链霉素、庆大霉素，既含有氨基糖苷，也含有氨基环醇大环内酯类：红霉素、麦迪加霉素，含有一个大环内酯作配糖体，以苷键和1-3个分子的糖相连四环类：四环素、土霉素，以四并苯为母核多肽类：多粘菌素、杆菌肽，含有多种氨基酸，经肽键缩合成线状、环状或带侧链的环状多肽,抗生素概述,抗

3、生素的作用的分类广谱抗生素：氨苄青霉素抗革兰氏阳性菌抗生素：青霉素抗革兰氏阴性菌抗生素：链霉素抗真菌抗生素：制霉菌素抗病毒抗生素：四环类抗生素抗癌抗生素：阿霉素,抗生素概述,抗生素的作用机制抑制细胞壁合成：青霉素、头孢菌素影响细胞膜功能：多烯类抗生素抑制病原菌蛋白质合成：四环素抑制核酸合成：丝裂霉素C,抗生素概述,我国抗生素工业的发展我国1953年设计制造了4个5吨发酵罐，建立上海第三制药厂，开始生产青霉素1957年建立华北制药厂经40多年来发展，国外有的基本抗生素品种我国都有生产，并已研制出国外没有的抗生素创新霉素等截止1996年上半年，总计127个品种生产，总产量近几年3万吨，约占世界抗生

4、素产量的1/4。农用抗生素研究生产也获得了可喜的成绩，灭瘟素、春日霉素和有效霉素等。,抗生素概述,我国抗生素产品种类齐全。在抗生素/抗菌素领域，我国具有一定的优势的是青霉素、四环素、氯霉素、土霉素、链霉素、螺旋霉素以及磺胺类产品，其中青霉素规模最大，我国青霉素年产量超过2.2万吨，约占全球市场的70%，2002年出口额达1.59亿美元，我国青霉素生产基本上集中于华药、哈药、石药和鲁抗四家，四家产量占国内青霉素总产量的75%。,抗生素概述,一、概况,第一节 概述,1929:Fleming在葡萄球菌培养皿中，污染的霉菌周围出现透明的抑菌圈。,杀菌物质，断言太不稳定，无法分离并用作药物。1939：牛

5、津病理家Howard Florey化学家Ernst Chain,Norman Heatley。发酵瓶培养霉菌，培养里提取，测活性，青霉素结晶。1940:8只鼠注射链球菌，提取物对4只治疗。未经治疗鼠在24小时内死亡，治疗鼠存活数天至数周。1941年2月开始治疗第一批人类病人。1943：威斯康辛大学小组，取得突破,生产菌表面培养：几十个单位。深层培养产黄青霉：100U/ml。X、UV诱变育种：10001500U/ml。不产色素变种：6600070000U/ml目前：85000U/ml。,一、概况内酰胺类抗生素：含有-内酰胺环的抗生素 青霉素类，头孢菌素类、硫霉素类、头霉素类、单环内酰胺类目前品种

6、最多、使用最广泛的抗生素,第一节 概述,分子结构及衍生物,如6-氨基青霉烷酸（6-APA）：侧链基团不同，形成不同的青霉素G：苄基青霉素，C6H5CH2-CO-，为主双氢霉素F：戊青霉素X：对羟苄基青霉素F：2-戊烯基青霉素K：庚青霉素V：苯氧甲基青霉素产品：钠、钾、普鲁卡因、二苄基乙二胺,-Lactams,青霉素类,头孢菌素类,头霉素类,碳青霉烯类,单环-内酰胺类,氧头孢烯类,结构中都含-内酰胺环，为抗菌活性之关键。,通过改造6-APA或7-ACA获得大量各具特点的抗生素。,第一节 概述,一、概况,一、概况,青霉素,s,o,s,c,青霉素 及 半合成青霉素类 青霉素类 2-烯 O代S 青霉烯

7、类 氧青霉烷类 C代S 碳青霉烯类,二、作用机制1.与细菌胞膜上青霉素结合蛋白(PBPs)结合，阻碍细胞壁肽聚糖合成，使胞壁缺损，菌体膨胀裂解。2.激活细菌自溶酶。,第一节 概述,三、临床应用的主要内酰胺类抗生素青霉素类：天然青霉素（青霉素G、青霉素）侧链改造（氨苄青霉素、羟氨苄青霉素等）头孢菌素类：天然头孢菌素（头孢菌素C、头霉素C）半合成衍生物（头孢克罗、头孢西丁等）碳青霉烯类：天然（噻纳霉素等）衍生物（亚胺青霉烯等）单环-内酰胺类：天然（单菌胺类）衍生物（氨曲南等）,第一节 概述,一、天然青霉素（主要有五种：G、V、X、N、K，临床常用G和V）青霉素G：不耐酸，不耐酶青霉素：耐酸，不耐酶

8、，抗菌同G，活性较弱工业上，用固定化青霉素酰化酶水解G或V来制备6-氨基青霉烷酸6-APA，再用化学或酶法添加侧链，获得半合成青霉素。,第二节 青霉素,二、菌种改良与保存（一）菌种改良：点青霉（固）产黄青霉（沉没）70年代前诱变和随机筛选据合成途径理性化筛选原生质体诱变选育基因工程技术育种。现世界工业发酵水平达85000u/mL（二）菌株保存真空冷冻干燥：分生孢子甘油等悬浮-70或液氮：分生孢子或菌丝,第二节 青霉素,青霉素生产菌株原生质体诱变选育与生产应用1992年，石家庄制药集团河北中润制药有限公司（原河北制药厂）生产菌株发酵效价和发酵指数低的问题。对青霉素生产菌产黄青霉进行了原生质体连续

9、诱变，选育出了高产菌株。按照计划，生产菌株JS94-18为初发株原生质体诱变筛选JS94-18-58。1994年应用于生产，50吨发酵罐发酵203小时平均发酵单位49310u/ml，最高为53000u/ml，平均发酵指数为2.75Bu/hm3。发酵单位和发酵指数分别比原生产菌株提高了10.40%、11.79%。,第二节 青霉素,第二次以JS94-18-58为初发菌株原生质体诱变等H94-9-61菌株。菌落和菌丝形态发生了明显变化，新菌株菌落凸起、呈偏口状、菌褶增加，菌丝短粗、菌隔增多。1996年应用于生产，203小时平均发酵单位为52515u/ml，比JS94-18-58菌株提高了6.5%；发

10、酵指数为3.05，比JS94-18-58菌株提高了10.91%。同时H94-9-61菌株对糖、氮的利用率高，对发酵液溶氧需求大大下降，增加了生产效率。1996年之后，生产上一直使用H94-9-61菌株。随着菌种的进一步分离纯化和生产工艺的优化，使生产发酵单位稳定在56000-58000u/ml，发酵指数。新菌株H94-9-61的应用，大大提高了生产效率，为企业新增加经济效益上亿元。,第二节 青霉素,二、菌种改良与保存,利用基因工程技术对新生产菌种进行了改造，大幅度提高了菌种的生产性能，通过120吨发酵罐生产应用，发酵效价和发酵指数均提高到新水平。新菌种属于丝状菌，菌落直径较小，凸起较高，菌褶增

11、多。该菌种产抗生素能力强，效价增长较快，165170小时效价可达到60000u/mL，192小时效价可达到70000u/mL以上（最高生产实验罐达到80000u/mL）。新菌种平均发酵效价达到70000u/mL以上、发酵指数平均达到4.0Bu/hm3以上（最高生产实验罐达到4.6亿/小时立方米），该菌种的生产成本大幅度的下降，是目前青霉素发酵生产最为理想的菌种之一。,第二节 青霉素,二、菌种改良与保存,我国青霉素的质量标准、临床效果可以说基本上已与世界顶尖企业接轨，青霉素的产量已在国际市场上占到60的份额，再加上价格优势，中国产品的竞争优势自然不言而喻。同时，我们也应当注意到，我国青霉素工业菌

12、种的发酵能力，发酵指数和生产成本与国外企业相比还有很大差距，国外工业菌株发酵能力约是我国的1.8倍，其发酵成本仅占售价的25%，而我国发酵产品的生产成本占到售价的50%60%。这使得我国发酵产品的利润空间和发酵工业的赢利能力远低于国外同类企业。我国更多是以规模生产在国际市场参与竞争。,第二节 青霉素,二、菌种改良与保存,（三）青霉素生产菌的生物学特性产黄青霉：Penicillium chrosogenum孢子：绿色和黄色菌落：平坦或皱褶，圆形。青霉穗：分生孢子链状深层培养菌丝：球状和丝状两种。,发酵培养下的生长过程及细胞学变化第1期：分生孢子萌发，具有小泡。第2期：菌丝繁殖，嗜碱性，类脂肪小颗

13、粒。第3期：脂肪包涵体，贮藏物，嗜碱性很强。第4期：空泡，嗜碱性减弱，开始产生抗生素。第5期：大空泡，中性染色大颗粒，脂肪包涵体消失，青霉素产量最高。第6期：个别细胞自溶，胞内无颗粒，释放氨，pH上升。第7期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。,镜检控制规定时间取样，显微镜观察7个时期的态变化，控制发酵。14期为菌丝生长期，3期的菌体适宜种子。45期为生产期，生产能力最强，通过工程措施，延长此期，获得高产。第6期到来之前结束发酵。,三、青霉素发酵生产（一）流程及工艺要点冷冻干燥孢子琼脂斜面米孢子种子罐发酵罐过滤青霉素回收,第二节 青霉素,消沫剂,补料C、N及前体,菌丝体,丰富的孢子,大量健壮的菌丝体

14、,生长阶段：使菌丝快速生长,生产阶段：用糖控制最低比生长速率，有利于青霉素大量合成,发酵工艺过程1、生产孢子制备工序斜面种子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的固体培养基进行培养米孢子：移植到小米或大米固体培养基上，生长7天，25注意：每批孢子必需进行严格摇瓶试验，测定效价及杂菌情况。,2、种子罐培养工艺一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝。培养基：葡萄糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消沫剂等。空气流量1：3（体积比）；300-350r/min；pH自然，温度271,40h二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖。接种量10 培养基：葡萄糖、玉米浆，玉米油，消沫剂等。1:1-1.5；250-280r/m

15、in；pH自然，251。10-14h质量：菌丝致密，菌丝粗壮，III期，倍增期6-8h,发酵工艺过程,3、生产罐培养工艺三级罐：生产罐；接种量20培养基：花生饼粉，葡萄糖，尿素，硝酸铵，硫代硫酸钠，苯乙酰胺，CaCO3,玉米油,硅油。参数条件：通气量；150-200r/min；前60小时：，26；60小时后：pH6.7，24。,发酵工艺过程,4、发酵培养与过程控制操作方式：反复分批式发酵发酵罐：100M3，装料80M3.带放:6-10次，带放量10，间隔24h。发酵周期：180-220h,发酵工艺过程,（1）过程控制补料分批操作控制基质浓度前40小时：培养基中的主要营养物40小时后：低速连续补

16、加葡萄糖、氮源和苯乙酸等，维持一定的最适浓度。半饥饿状态：延长合成期，提高产量。碳源占成本12以上，采用糖化液流加，降低成本。糖与6APA结合形成糖基-6APA，影响青霉素产量。,流加碳源控制根据残糖、pH、尾气中CO2和O2含量。葡萄糖的波动范围较窄，浓度过低使抗生素合成速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，甚至引起自溶。残糖左右，pH开始升高时流加糖。浓度：500kg/M3，流速3.h,过程控制,流加氮源控制玉米浆:最好，含有多种氨基酸及其前体苯乙酸和衍生物。补加无机氮源：硫酸铵、氨水、尿素氨基氮浓度：0.01-0.05%。,盐离子控制无机盐：硫、磷、镁、钾等。铁对青霉素合成有毒，30-

17、40g/mL以下。罐壁涂环氧树脂保护层。,（2）添加青霉素侧链前体时期：合成阶段种类：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸毒性：抑制细胞生长和青霉素合成。策略：低浓度流加浓度：苯乙酸0.1%，苯乙酰胺0.05-0.08%控制：保持供应速率略大于生物合成需要。,（3）温度控制适宜菌丝生长温度30，分泌青霉素20。20青霉素破坏少，周期很长。变温控制，不同阶段不同温度。生长阶段:较高温度，缩短生长时间；生产阶段适当降低温度，以利于青霉素合成。前期控制26左右，后期降温控制24,（4）pH控制合成适宜pH6.46.6左右，避免超过7.0直接加酸或碱：自动控制pH下降：补加CaCO3、通氨

18、、尿素或提高通气量pH上升：补加糖、生理酸性物质（硫酸铵、油脂）,（5）溶氧控制若30饱和度，产率急剧下降；若10，造成不可逆的损害。临界溶氧浓度：30。通气比：1：0.81.5。适宜的搅拌速度:保证气液混合，提高溶氧调整搅拌转速:各阶段的生长和耗氧量不同。,（6）消沫天然油脂：玉米油；化学消沫剂：泡敌。策略：少量多次。注意：前期不宜多加入，影响呼吸代谢。,（二）影响青霉素发酵产率的因素环境变量：基质浓度温度pH溶氧生理变量：菌丝浓度菌丝生长速度菌丝形态基质浓度：由于（葡萄糖、铵、苯乙酸）产生阻遏或抑制，故采用流加补料分批发酵。温度：生长最适30，生产25。pH：最适6.5，尽量7.0溶氧：一

19、般溶氧浓度30%，但过高说明菌丝生长不良或加糖率过低等。可作为补料的参考指标。,第二节 青霉素,（二）影响青霉素发酵产率的因素菌丝浓度：传氧速率（OTR）与摄氧速率（OUR）相平衡时的菌体浓度临界菌体浓度。使此值，但临界菌体浓度可提高。菌丝生长速度：临界比生长率青霉素：c=0.015/h，依此，46h菌浓应翻番，但与实际有别菌丝形态：丝状：与基质、氧充分接触，生产率高，应保持适当长度，防结球结球：粘度小，气/液间传氧率高，临界菌体浓度高，生产率甚至高于前者,第二节 青霉素,青霉素发酵,菌种(strain)：产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)孢子培养(spore cul

20、tivation)：25 C,6-7 d种子培养(seed cultivation)：25 C，2-3 d 发酵培养(fermentation)：22-26 C,6-7 d加糖控制(sugar feeding)：残糖降至0.6补氮(nitrogen feeding)：氨控制在 前体(precursor)：残余苯乙酰胺 温度控制(temperature)：前期 25-26 C 后期 23 C通气与搅拌(aeration&stir)：1:0.8 VVM泡沫(foam)：天然油脂,如豆油,四、青霉素的生物合成与理论生产得率（该部分自学）,第二节 青霉素,头孢菌素C是继青霉素之后在自然界发现的又一类重

21、要的内酰胺抗生素。迄今，通过 化学改造，已制备出数以千计的半合成头孢菌素化合物，其中已有数十种在市场供应，是目前世 界上销售额最大的抗生素之一。,第三节 头孢菌素C,头孢菌素C,头孢菌素C（天然头孢菌素中活性最强的）结构特点,A,B,一、生物合成与代谢调控(一)生物合成概述头C也是由-氨基己二酸、半胱氨酸和缬氨酸经三肽途径生物合成的，而且，在异青霉素N以前的阶段和青霉素的生物合成完全一样。此后，经顶头孢霉产生的异构酶作用，将异青霉素N转化为青霉素N，再由扩环酶催化扩环生成脱乙酰氧头孢菌素C，最后通过羟化和转乙酰基反应得到头孢菌素C。,第三节 头孢菌素C,(二)顶头孢霉的硫代谢 硫可以通过两种途

22、径由顶头孢霉摄入头孢菌素C分子：一种是和青霉素发酵一样的硫酸盐还原途径，另一种是蛋氨酸的逆转硫途径。野生顶头孢霉菌株不能利用硫酸盐，故只能以蛋氨酸为基质。主要通过逆转硫途径提供硫。通过突变筛选获得的能有效利用硫酸盐的工业生产菌株，可在不加蛋氨酸的情况下高效地合成头孢菌素C。,第三节 头孢菌素C,(二)顶头孢霉的硫代谢,第三节 头孢菌素C,SO42-,(三)生物合成中的调控反应 葡萄糖等快速利用的碳源阻遏头孢菌素C的生物合成。较高葡萄糖浓度青霉素N积累增加而头孢菌素C产率，说明葡萄糖主要阻遏扩环酶的生成。葡萄糖接近耗尽时，头孢菌素C才大量合成。碳源限制流加补料发酵可显著提高头孢菌素C的产率。在分

23、批和补料分批发酵中，用代谢慢的植物油做碳源也可以避免碳源阻遏。,第三节 头孢菌素C,(三)生物合成中的调控反应顶头孢霉发酵液中存在乙酰酯酶，能将头孢菌素C水解生成脱乙酰头孢菌素C（抗菌活性很弱）。且影响头C的分离和提纯。对于某些菌株，碳源的存在可抑制乙酰酯酶的活性，故在发酵液中保持一定的碳源浓度对于防止头C的水解是一个决定性因素。另外，避免发酵过程中温度和pH的异常升高，对减少脱乙酰头孢菌素C的生成有一定作用。,第三节 头孢菌素C,二、菌种选育与保存顶头孢霉M8650工业生产的原始亲株，几乎所有高产菌株都是由它反复诱变、筛选得到。诱变蛋氨酸营养缺陷株转入用含硫化合物(如硫酸盐)代替蛋氨酸的基本

24、培养基筛选不需要蛋氨酸的高产突变株，降低发酵成本。原生质体融合也是高产菌株选育的一种有效方法。用现代基因工程技术构建含克隆的扩环羟化酶基因的质粒，将其转人工业生产菌株中，获得显著提高头孢菌素C生产能力的基因工程菌。,第三节 头孢菌素C,遗传改良后的顶头孢霉，平板上的菌落直径缩小(1015mm35mm)、颜色变浅；生孢子能力有退化的趋势，不利于保存。用原生质体融合育种，可改善菌株的孢子生成状况。菌株的保存：采用冷冻干燥法或液氮法保存营养菌丝。经长期保存后，生命力的恢复较差，故应对其进行复壮，恢复菌株生命力和生产能力。,三、发酵过程优化(一)培养基没有一种普遍适用的一成不变配方，在每个新菌株用于生

25、产之前，都必须对培养基进行再优化试验。氮源：玉米浆（优良氮源，含丰富的氨基酸、肽、蛋白质和微量元素，起始用量一般为26g(N)L）。其他氮源有花生饼粉、硫酸铵、氨、尿素等。当基础培养基中的氮源消耗到一定程度时，要不断补入硫酸铵或氨，以维持发酵液中铵氮含量在0.50.7gL之间。补氨还能起到控制pH的作用(一般在67之间)。,第三节 头孢菌素C,(一)培养基碳源：葡萄糖、糊精、淀粉或植物油。植物油通常作为流加碳源，而其他加入基础培养基中。玉米浆中所含的有机酸可以作为前期菌丝生长的优良碳源。若流加豆油，放置使卵磷脂沉淀后再使用为好。其他：通常还要添加无机盐以满足菌丝生长对Mg2+、PO43-等的需

26、要。蛋氨酸。,头孢菌素C发酵过程的典型物质消耗如下：,表155 头孢菌素c发酵过程的物质消耗,三、发酵过程优化(二)通气与搅拌在头孢菌素C发酵中要求较高的氧传递速率，溶氧浓度25饱和度。原因：三肽的环化、青霉素N的扩环和脱乙酰氧头孢菌素C的羟化都是氧化反应。搅拌输入功率为4kWm3(发酵液)以上。严格控制油的流加（碳源；增加氧传递阻力），使溶氧始终保持在25饱和度以上。,三、发酵过程优化(三)菌丝生长速率用葡萄糖作为生长限制基质进行的恒化器实验表明，菌丝比生长率与抗生素比生产率成反比。但用豆油作为生长限制基质时，比生长率则与比生产率成正比；比生长率由0.01h提高到0.04h，比生产率增加到2

27、倍。因此，在前一种情况下，与其说是生长率的影响，不如说是葡萄糖的碳源调控在起作用。,三、发酵过程优化(四)菌丝形态 在头孢菌素C发酵过程中，产生菌顶头孢霉呈现明显的形态分化。形态分化是头孢菌素C生物合成启动的关键要素。在快速生长期，菌体以细长的丝状为主；随着营养的消耗和比生长率的下降，菌丝开始膨胀、断裂，最后形成单细胞的节孢子。节孢子可发育成新的菌丝，产生新的生长循环。,第三节 头孢菌素C,三、发酵过程优化(四)菌丝形态 节孢子arthrospore菌丝生长到一定阶段，长出许多横隔，然后从横隔处断裂，产生许多单个孢子，即节孢子，又称粉孢子。具有进行繁殖和摆脱不适宜的环境的作用。常见于放线菌类和

28、担子菌类的气生菌丝。,第三节 头孢菌素C,三、发酵过程优化(四)菌丝形态 图1514说明，在菌株选育过程中，随着菌株生产能力的提高，形成节孢子的能力呈增加的趋势。,三、发酵过程优化(五)发酵终点 应根据产率、产物组成、成本、效益、过滤速度等各方面的情况，综合考虑，把握发酵终点，以达最大生产效益。头孢菌素C是不稳定的化合物，存在非酶降解，且头孢菌素C浓度，绝对降解量逐渐；乙酰酯酶转化头孢菌素C为脱乙酰头孢菌素C。发酵时间的延长，菌丝自溶，发酵液难以过滤。,四、7-氨基头孢烷酸 7-ACA的酶法制备与直接发酵生产头孢菌素C通过两个酶，即D-氨基酸氧化酶及戊二酰7-ACA酰化酶的作用，可以生成7-A

29、CA。1990年中国科学报报导了中国科学院植物生理研究所，以头孢菌素C为原料，二步酶法制备7-ACA获得成功。,第三节 头孢菌素C,四、7-ACA的酶法制备与直接发酵生产(一)7-ACA的酶法制备,(一)7-ACA的酶法制备,第二步:GL-7-ACA酰化酶用阴离子树脂为载体，戊二醛为交联剂，制成固定化酶，在温度1525、pH7.58.5下进行酰化反应,7-ACA可以用等电点结晶法精制。,(二)7-ACA的直接发酵生产假单胞菌SE83(Pseudomonas SE83)和缺陷假单胞菌(Pseudomonas diminuta V22)能产生直接水解头孢菌素C生成7-ACA的酰化酶。将这一酰化酶基

30、因克隆到头孢菌素C产生菌中，使该菌在产生头孢菌素C的同时，将部分头孢菌素C脱酰基生成7-ACA，从而开创了直接发酵生产7-ACA的一种可能途径。,1986年日本有了一步酶法制备7-ACA的专利申请。,第四节 其他重要的-内酰胺抗生素,一、头霉素C头霉素与头孢菌素具有相同的母核，故有时也归入头孢菌素类。它们的主要区别在于头霉素在7位上有一个甲氧基，从而增加了-内酰胺环的稳定性，使其能够耐受-内酰胺酶。,第四节 其他重要的-内酰胺抗生素,一、头霉素C(一)产生菌 头霉素C主要由内酰胺诺卡氏菌(Nocardia lactamdurans)和克拉维链霉菌(Strepto myces clavulige

31、rus)生产。,第四节 其他重要的-内酰胺抗生素,一、头霉素C(二)生物合成与代谢调控 和青霉素及头孢菌素一样，头霉素C也是由-氨基己二酸、半胱氨酸和缬氨酸经三肽途径生物合成的。图15-17说明了头霉素C分子各部分的代谢来源。扩环反应是头霉素C生物合成的限速阶段。已知甘油阻遏扩环酶的生成但不抑制其活性，而糖酵解途径磷酸化中间产物葡萄糖-6-磷酸和果糖-1，6-二磷酸强烈抑制该酶的活性。因此，葡萄糖、麦芽糖和甘油的过量加入都将降低头霉素C的发酵产量。,第四节 其他重要的-内酰胺抗生素,一、头霉素C(二)生物合成与代谢调控 过量磷酸盐阻遏三肽合成酶和扩环酶的生成，并抑制环化酶和扩环酶的活性。102

32、5molm3的磷酸盐支持一定量的产生菌生长，且适合于抗生素合成；低于10molm3，产生菌的生长和抗生素合成都将受到限制；大于25molm3时，生长进一步增加，而抗生素产量呈下降趋势。过量的NH4+阻遏三肽合成酶、环化酶和扩环酶的生成，而对这些酶的活性没有明显影响。赖氨酸及Fe2+对头霉素C的生物合成有刺激作用。,第四节 其他重要的-内酰胺抗生素,一、头霉素C(三)发酵生产 发酵培养基的组成为(gL)：一水葡萄糖40，甘油12，棉籽饼粉20，玉米浆20，DL-赖氨酸1.0，二甲基甲酰胺9.2，Na2S203 0.5，聚乙烯醇P2000 0.15，pH7.0。发酵过程的代谢变化如图15-18所示

33、。,头孢菌素类发展很快，可分四代第一代：头孢噻吩、头孢氨苄、头孢唑啉第二代：头孢呋辛、头孢孟多第三代：头孢他定、头孢曲松、头孢噻肟、头孢唑酮第四代：头孢匹罗头孢菌素类对-内酰胺酶一代比一代稳定；对肾的毒性一代比一代低；前三代对G+菌的抗菌力一代不如一代，而对G菌的抗菌力则一代比一代强；第四代对G+、G的抗菌力都很强。第三代和第四代都能透入脑脊液。,头孢菌素C,提炼工艺过程青霉素不稳定，遇酸、碱、热分解失活水溶液中不稳定，非极性溶剂中稳定易溶于有机溶剂，水中溶解度很小青霉素盐很稳定；降解产物具有致敏性防止降解，条件温和、快速。,青霉素生产工艺,1、预处理青霉素的存在部位：发酵液浓度较低：1030

34、Kg/M3含有大量杂质：菌体细胞、核酸、杂蛋白质、细胞壁多糖等、残留的培养基、色素、盐离子、代谢产物等目的：浓缩目的产物，去除大部分杂质，改变发酵液的流变学特征，利于后续的分离纯化过程。预处理:发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白,2、过滤鼓式真空过滤机过滤：一次滤液：，略浑，棕黄或绿色，蛋白质含量0.5-2.0%。板框式过滤机过滤：硫酸调节，加入0.07%溴代十五烷吡啶，0.07%硅藻土为助虑剂。二次滤液：澄清透明，用于提取（收率90）,3、溶剂萃取原理：青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素盐易溶于水。萃取剂：青霉素分配系数高的有机溶剂。工业上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。除去蛋白质：加0.05-0.1

35、%乳化剂溴代十五烷吡啶（PPB）。萃取：23次。,萃取过程正相萃取：酸化，滤液：醋酸丁酯1：0.3，碟片式离心机分离（浓缩）反相萃取：（磷酸盐、碳酸盐缓冲液）。把青霉素从丁酯中提取到缓冲液中。反复萃取23次，达到结晶要求。萃取条件：10下。萃取罐冷冻盐水冷却。,4、脱色萃取液中添加活性炭，除去色素过滤，除去活性炭。5、结晶直接结晶加醋酸钠乙醇溶液反应：得到结晶钠盐。加醋酸钾乙醇溶液：得到青霉素钾盐。,5、结晶共沸蒸馏结晶萃取液，再用0.5 M NaOH萃取下得到钠盐水浓缩液。加3-4倍体积丁醇，16-26，真空）下蒸馏。水和丁醇形成共沸物而蒸出。钠盐结晶析出。结晶经过洗涤、干燥（60真空16h），磨粉，装桶，得到青霉素产品。,思考题：青霉素发酵参数的控制 影响青霉素发酵产率的因素 头孢菌素C和青霉素的合成途径有何异同顶头孢霉的硫代谢在发酵上的表现 头孢菌素C发酵中对氧的要求青霉素发酵液的溶剂萃取工艺,