生化分离技术与血液制品.ppt

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1、生化分离技术与血液制品,第一节生化分离技术,1、生化分离技术的特点,1）、通常处理的发酵液或酶反应液中产品的浓度很低。溶液中欲提取物质的浓度越低，提取时所耗费的能量就越大，费用也就越高，产品的价格也越高。一般来说，生物物质的分离式十分困难的。2）、生物产品很多是生化活性物质，易受坏境因素如温度、PH、金属离子和微生物等的影响，甚至失活，因而也增加了分离的难度。3)、对最终产品的质量往往要求极高,2、生化产品的特点,1)应用面广。医药卫生、环保、动植物生长调节、食品和试剂等 2)生化产品种类繁多，包括了大、中、小分子量的结构和性质复杂又各异的生物活性物质，生物活性各异。3)目的产物在初始物料中的

2、含量低。青霉素（4.2%）、庆大霉素（0.2%）、干扰素（50ug/ml）。4)产品价格与产物浓度呈反比,5)初始物料成分复杂。除少量产物外，还有大量的细胞及碎片、其他代谢物（几百上千种）、培养基成分、无机盐等。6)生物活性物质的稳定性低。易变质、易失活、易变性，对温度、pH值、重金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等非常敏感。7)产品的质量要求高，尤其是药品等。成品青霉素对其强致敏原青霉噻唑蛋白必须控制RIA值（放射免疫测定）小于100（1.510-6），蛋白类药物（杂质2%）、重组胰岛素中杂蛋白小于0.01%。,线粒体(双层膜)是细胞进行有氧呼吸的主要场所。细胞生命活动所需能量的95%来自

3、线粒体。,叶绿体(双层膜)是绿色植物细胞进行光合作用的场所。,内质网是细胞内蛋白质合成和加工，以及脂质合成的“车间”,植物细胞结构,线粒体,结构：,双层膜,外膜,内膜。内膜向内折叠形成嵴,基粒：位于嵴上基质：内含大量的氧化酶含有少量的DNA、RNA,外膜,内膜,嵴,基粒,叶绿体,结构：,双层膜,外膜,内膜,基粒：由多个类囊体垛叠而成。位于内膜中。基质：内含大量的光和作用酶含有少量的DNA、RNA,高尔基体,分布：动植物细胞，结构：单层膜功能：与细胞分泌物形成有关，对蛋白质进行加工和转运（“发送站”），植物细胞分裂时与细胞壁的形成有关。,液泡,分布：植物细胞结构：单层膜，膜内液体叫细胞液，液泡内

4、有色素、糖类、蛋白质等；,核糖体是由蛋白质和RNA组成,有附着型的、有游离型的，是生产蛋白质的机器。(氨基酸脱水缩合的反应就在核糖体上进行的),细胞破碎就是采用物理、化学、酶或机械的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中。,概念,细胞破碎机理图,不同细胞破碎的难易程度,植物细胞真菌（如酵母菌）革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌动物细胞。,细胞破碎的方法,高压匀浆法,珠磨法,超声破碎法,渗透压法,反复冻融法,干燥法,X-press法,1.物理破碎,高压匀浆法（High-pressure homogenization）大规模细胞破碎的常用方法,原理：细胞悬浮液在高压的

5、作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。,高压匀浆器,压力(工业生产中常用5570MPa的压力)循环操作次数(多次循环的操作方法)温度,高压匀浆法中影响细胞破碎的因素:,不宜采用高压匀浆法的微生物：,易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）,适用于：微生物细胞和植物细胞的大规模破碎。,进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌

6、或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。,珠磨法（Bead mill）,工作原理：,卧式,WSK卧式高效全能珠磨机,ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机,影响细胞破碎的因素,b.珠体的装量,a.珠体的大小,c.搅拌速度,d.操作温度,e.被处理细胞的特性,实验室规模，珠径0.2mm，工业规模珠径大于0.4mm,8090,适当,540,珠磨法的破碎率一般控制在80以下,其原理可能与空穴现象引起的冲击波和剪切作用有关。,超声破碎法（Ultrasonicatio

7、n）,超生波破碎细胞时的频率一般为1520 kHz，功率为100250W，可分为槽式和探头直接插入介质式两种型式。,影响超生波破碎的因素,声强、频率、破碎时间、介质的离子强度、pH菌体的浓度和种类。,一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。超声破碎时细胞浓度一般在20左右。,超声波应用,超声波破碎法在实验室和小规模生产中应用较广。操作时常应把悬浮液预先冷却到05，并且还应在夹套中连续通入冷却剂进行冷却。,另外，超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。可以通过添加自由基清洗剂如胱氨酸或谷胱甘肽，或用氢气预吹细胞悬浮液来缓和。,将细胞放在高渗透压的介质中（如

8、一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。,渗透压冲击法,仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。,将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。,反复冻融法,缺点：适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。,使细胞膜结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。

9、当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。,（6）干燥法,气流干燥主要适用于酵母菌，一般在2530的气流中吹干；真空干燥多用于细菌；冷冻干燥适用于较不稳定的物质。,此法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔挤出，由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而破碎。,（7）X-press法,该法主要用于实验室，具有使用范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点。不适用于对冷冻敏感的物质。,酶溶法,化学试剂破碎法,外加酶法自溶法,表面活性物质EDTA螯合剂有机溶剂变性剂,2.化学破碎（Chemi

10、cal permeation）,（1）酶溶法（Enzymatic Lysis）,外加酶法,常用的溶酶,G+溶菌酶、适量抑制剂G-溶菌酶、EDTA放线菌 溶菌酶酵母菌-葡聚糖酶霉菌 几丁质酶、植物 纤维素酶、半纤维素酶,细胞壁溶解酶是几种酶的复合物,选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。,溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在。在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。,酶溶法的优点：,酶溶法的缺点：,缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,（2）自溶法（Autolysis）,诱发

11、微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。微生物细胞的自溶常采用加热法和干燥法。,影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、缓冲液浓度和细胞代谢途径等。,某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。,（2）化学试剂破碎法（Chemical permeation）,该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。,用碱处理细胞，可以溶解除去细胞壁以外的大部分组分。酸处理可以使蛋白质水解成游离的氨基酸。,如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲

12、和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠、吐温等也可使细胞破碎。,表面活性剂,可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。,处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。,EDTA螯合剂,能溶解细胞壁中的磷脂层，使细胞破坏。,有机溶剂,变性剂,盐酸胍（Guanidine hydrochloride

13、）和脲（Urea）是常用的变性剂。,常用的有机溶剂：丁酯、丁醇、甲苯、二甲苯、氯仿及高级醇等。,变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。,通用性差；时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%有些化学试剂有毒。,化学法的优点：,缺点：,对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,细胞破碎效果的检查,破碎率定义:被破碎的细胞的数量占原始细胞数量的百分数，即,其中N0：原细胞数，N：破碎后残存的正常细胞。N0和N的可通过直接测定

14、法、目的产物测定法和测定导电率得到。,1.直接测定法,显微镜计数相对快速简单，采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。,方法：样本适当稀释后，通过平板计数技术或在血球计数板上用显微镜观察来实现染色细胞的技术。,平板计数法计数时间长；只有活细胞才被计数，误差大；细胞聚集时，不利计数。,2.目标产物测定法,Rm：理论最大值，R：实验测得值。,将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得的标准数值比较，计算其破碎率。,3.测定导电率,细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。导电率随着破碎率的增加而呈线性增

15、加。,导电率的大小取决于微生物的种类、处理的条件、细胞的浓度、温度和悬浮液中原电介质的含量等，因此，正式测定前，应预先用其它方法测定标准曲线。,选择破碎方法时，需要考虑下列因素：,选择破碎方法的依据,1.处理量的大小,2.细胞壁 的强度和结构,3.目标产物对破碎条件的敏感性,4.破碎后固液分离的难易程度,适宜的操作条件应从高的产物释放率、低的能耗和便于后步提取这三方面权衡。,盐析法 盐析法是指在药物溶液中加入大量的无机盐，使某些高分子物质的溶解度降低沉淀析出，而与其他成分分离的方法。盐析法主要用于蛋白质的分离纯化。常作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。,蛋白质在水溶液中的溶解度取

16、决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。,同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而使之从其他蛋白中分离出来。简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素

17、去除而沉淀。,等电点沉淀法,等电点沉淀法是利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。,原理,在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。等电点时的许多物理性质如黏度、膨胀性、渗透压等都变小，从而有利于悬浮液的过滤。,酪蛋白等电点沉淀法快速鉴别奶粉和乳清粉,前言：奶粉和乳清粉在外观上很相近,水溶液性状亦相似,直接很难区分。,乳清粉不含酪蛋白,只含乳清蛋白,而常规的全

18、脂奶粉、脱脂奶粉以及其他调制奶粉等均含有酪蛋白。实验中,以酸调节待测样品水溶液pH 值至4.6 附近，奶粉溶液有白色絮状凝块从溶液中沉淀出来,乳清粉溶液,则无此沉淀反应,利用这个现象立即就可以将奶粉和乳清粉区别开来。,四、萃取分离,萃取：指液-液萃取，利用物质在两个互不相溶的液相之间分配特性不同类进行分离的过程。一般流程：萃取剂和含有目标成分的料液混合接触 分离不相溶的两相并回收溶剂 萃余液脱除溶剂 萃取液：离开萃取器的萃取剂萃余液：经萃取剂相接触后离开的料液,单级萃取 溶剂萃取技术 多级萃取 萃取技术 双水相萃取技术 超临界流体萃取,（一）溶剂萃取 溶剂萃取技术是利用目的物在两种互不相容的溶

19、液中的溶解度不同，使其从一种溶液中转移到另一种溶液中，以达到浓缩和提纯的目的。在溶液萃取中，被提取的溶液称为料液，其中所含的被提取的物质称为溶质，用来进行萃取的溶剂称为萃取剂。,I2水溶液,原因:I2在CCl4中的溶解度大于在水中的溶解度，I2在相间的转移是物理过程。而更多的情况下，被萃取对象要与试剂（萃取剂）发生化学作用。,CCl4,I2/CCl4,H2O,实例:,萃取过程的分离效果主要表现为被分离物质的萃取率，萃取率为萃取剂中被萃取成分与原溶液中该成分的溶质的量之比。萃取率越高表明萃取分离的效果越好。萃取分离的影响因素主要有：萃取剂、分配系数、在萃取过程中两相之间的接触情况。在一定情况，被

20、萃取物的分离效果主要取决于萃取剂的选择和萃取次数。选择合适的溶剂是溶剂萃取分离的关键。,溶剂选择应遵循的原则：1、与水溶液不相溶，对目标成分有高的分配系数，溶剂本身低粘度，与水有较大的密度差；2、消毒过程中热稳定性好；3、对生物活性成分、细胞无毒性，对人员无毒性、低成本，能大批量供应，不易燃。,按工业上的萃取操作，可分为单级萃取和多级萃取1、单级萃取 是萃取操作的基本方式。使料液与萃取剂在混合过程中密切接触，让被萃组分通过相际界面进入萃取剂中，直到组分在两相间的分配基本达到平衡。然后静置沉降，分离成为两层液体，即由萃取剂转变成的萃取液和由料液转变成的萃余液。单级萃取达到相平衡时，被萃组分B的相

21、平衡比，称为分配系数K，即：K=yB/xB式中yB和xB分别为B组分在萃取液中和萃余液中的浓度。,2、多级萃取 将多个单级萃取单元串接起来可连续操作。主要有错流和逆流两种形式。多级逆流萃取萃取效率最高，在工业上广泛的应用。,（二）、双水相萃取,1896年Beijerinck发现：（明胶琼脂）或（明胶可溶性淀粉）混浊不透明溶液 两个有界面的液相,两相的主成分都是水 上相 富含明胶 下相 富含琼脂（或淀粉）,双水相萃取：将两种不同水溶性的聚合物/盐或者聚合物/聚合物系统混合，当各自的浓度达到一定值时，溶液体系会分为互不相容的两个水相，又称为水溶液两相分配技术。该技术应用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白

22、，改善了胞内酶的提取效果。双水相体系：能产生双水相现象的溶液体系。,可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）,聚丙二醇/聚乙二醇，甲基纤维素/葡聚糖。双水相萃取中采用的双聚合物系统是PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。另外，聚合物与无机盐的混合溶液也可以形成双水相，例如，PEG/磷酸钾（KPi）、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG,下相富含无机盐。,等体积的2.2%葡聚糖与0.72%的甲基纤维素的水溶液形成的双水相体系 上相：0.39%葡聚糖 0.65%甲基纤维素 98.96%水 下相：1.58%葡

23、聚糖 0.15%甲基纤维素 98.27%水,双水相萃取的应用 酶、核酸、生长激素、病毒等生物物质分离纯化萃取流程（右图）聚乙二醇（PEG）-磷酸盐体系萃取酶目标酶进入富PEG上相;富PEG上相中加盐后形成新双水相，目标酶进入上相。富PEG上相中加盐后形成新双水相，目标酶进入下相。,破碎的细胞 PEG/磷酸盐 下相：上相产物：目标蛋白质 细胞碎片、杂蛋 盐 白、核酸、多糖 形成PEG/磷酸盐体系 下相：核酸、上相产物：目标酶 杂蛋白、多糖 盐 形成PEG/磷酸盐体系 下相：目标酶 上相：PEG，蛋白质,双水相体系的特点：水含量达7090，组成双水相的高聚物及某些无机盐不会导致生物物质失活或变性，

24、有时有保护作用。可直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需蛋白质，还能不经破碎直接提取细胞内酶。易于进行工业放大，处理量可以较大。萃取后，含有聚合物的目标产物可以采用常用的分离手段（超滤、电泳、色层分离等）将聚合物除掉。,（三）超临界流体萃取(Supercrtical Fluid Extraction,SFE),1、超临界流体萃取的原理及特性,超临界流体(supercrtical fluid)：物质处于其临界温度Tc和临界压力pc以上时，即使继续加压也不液化，只是密度增加，它具有类似液体的性质，还保留气体的性质。,相图,超临界流体萃取：就是利用SCF的特性，通过改变临界压力或临界温度来提取和分

25、离各种化合物。许多物质都具有SCF的特性，但不是所有具有SCF特性的流体都可以用来做超临界流体萃取,作为萃取溶剂的超临界流体应具备的条件：1、具有化学稳定性，对设备没有腐蚀性；2、临界温度不能太高或太低，最好在室温附近或操作温度附近；3、操作温度应低于被萃取溶质的分解温度或变形温度；4、临界压力不能太高，以便节约压缩动力费；5、有较好的选择性，容易得到高纯度制品；,6、有较高的溶解度，以减少溶剂用量；7、萃取溶剂容易获取，价格便宜；8、萃取溶剂必须对人体没有任何毒性。CO2是用于生物活性成分临界流体萃取分离的理想溶剂,为什么说CO2是超临界流体萃取生物活性的理想溶剂？,CO2是安全、无毒、廉价

26、的液体，超临界CO2具有类似气体的扩散系数、液体的溶解力，表面张力为零，能迅速渗透进固体物质之中，提取其精华，具有高效、不易氧化、纯天然、无化学污染等特点。,超临界流体萃取可分为三种典型流程；1、等温法 萃取过程中温度不变。液体在萃取罐中因加压而成为SCF，溶解目标成分，在分离罐中因减压而变成普通气体，释放溶解成分，实现目标成分的萃取分离。2、等压法 萃取过程中压力不变。流体在萃取罐中因降温而成为SCF，溶解目标成分，在分离罐中因升温而变成普通气体，释放溶解成分，实现目标成分的萃取分离。,3、吸附法 萃取过程中温度、压力均保持不变，SCF萃取出的目标成分在分离罐中被吸附剂吸附，SCF返回萃取罐

27、重复利用。等温法和等压法流程主要用于萃取的溶质是需要精制的目标成分；而吸附法流程则适用于萃取的溶质是需要除去的有害成分，目标成分包含在萃余液中。,SFE的优点:萃取剂常温常压下为气体，萃取后方便与萃取组分分离。较低的温度和不太高的压力下操作，适合天然产物的分离。超临界流体溶解能力可通过调节温度、压力、夹带剂（如醇 类）在很大范围内变化；还可用压力梯度和温度梯度。,SFE的缺点：萃取率较低，选择性不够高。,大量饮食咖啡因对人体有害以往工业上除咖啡豆中咖啡因采用二氯乙烷萃取。缺点：（1）残留二氯乙烷影响咖啡品质；（2）二氯乙烷将部分有用香味物质（芳香化合物）带走。SFE除咖啡因：浸泡过的咖啡豆直接

28、置于萃取容器中，连续（循环）用超临界CO2萃取（T7090；p1620MPa）10小时，气体中的咖啡因用水吸收除去，蒸馏可回收咖啡因。经SFE处理后的咖啡豆中咖啡因含量从0.7-3%降低到0.02%。,实例1：从咖啡豆中除去咖啡因,五、过滤与离心,（一）过滤过滤是指利用多孔过滤介质阻留固体颗粒而让液体通过，使固液两相悬浮液得以分离的过程，是目前工业生产中用于分离细胞和不溶性物质的主要方法。虑浆：过滤操作所处理的悬浮液过滤介质：所用的多孔物质（丝网、滤布、硅藻土）滤液：通过介质孔道的液体滤饼（滤渣）：被截留的物质,过滤的方式有滤饼过滤和深层过滤 滤饼过滤容易再生，可以反复多次使用：但是深层过滤不

29、容易再生，过滤介质都是一次性的。,（二）、离心,离心分离是另一种固液分离的重要方法。固体颗粒在连续流动的悬浮液中受到重力、浮力和惯性离心力的多重作用。不同密度、大小及形状的颗粒，其重力沉降加速度、惯性离心加速度均不相同，从而在液相中沉降或移动的距离不同。这种利用惯性离心力实现不通颗粒分离的操作称为离心分离,离心分离可分为以下几种形式：1、离心沉降 利用固液两相的相对密度差，在离心机的无孔转鼓或管子中进行悬浮液的分离操作。离心设备有：瓶式离心机、三足离心机、碟式离心机等。2、离心过滤 这种方法兼有离心和过滤的双重作用，在有孔转鼓中同时设置过滤介质，通过离心产生过滤动力，完成过滤过程。3、超离心

30、指应用较大的惯性离心力将混合物相中的各个组分进行分离、浓缩和提纯。,超离心就是利用球形颗粒在悬浮液相中分布的差役，分离不同相对密度液体的操作。按照处理要求和规模又分为 制备型超离心和分析型超离心。其中制备型离心又有以下三种方法：（1）差速离心：一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒，如细胞匀浆液中细胞器的分离。,（2）速率密度梯度离心：仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒，与颗粒密度无关，如RNA-DNA 混合物等，但大小相同，密度不同的颗粒不能用此方法。（3）等密度梯度离心 当不同颗粒存在密度差时，在离心力场作用下，颗粒向外或向内移动到与它们密度正好相等的位置上并形成区带。,六、色谱分离,色谱法是一

31、种分离、分析方法。它利用被分离的诸物质在互不相溶的两相中分配系数的微小差异进行分离。当两相作相对移动时，使被测物质在两相之间进行反复多次分配，使原来微小的差异累加产生了很大的效果，形成差速迁移，使各组分在柱内移动的同时逐渐分离，以达到分离、分析及测定一些物理化学常数的目的。,色谱法的特点,1分离效率高：可在很短的时间内分离多达二、三百个组 分的复杂物质，柱效能可达106的理论板。2检测能力强：可以检测出10-1110-15克级的痕量组分，能 满足环境检测、农药残留等大量日常检测 分析的需要。3样品用量少：样品用量一般为微升级，少的可达纳克级。4适用范围广：几乎所有与化学有关的领域都有其用武之

32、地。,根据操作方式和目的的不同，色谱法可分为分析型色谱和制备型色谱。分析型色谱的目的是分析样品的组成信息制备型色谱的目的是制备、纯化产品在色谱分离中，其中一相的介质是不动的，称为固定相另一相介质携带含目标成分的原料，呈流体状流经固定相，称为流动相。,色谱分离过程：加试样 展开 分部收集目前，工业上常用到的色谱分离技术包括：凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、反相和疏水作用色谱法以及亲和色谱法。1、凝胶过滤色谱 凝胶过滤又叫分子筛色谱，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤色谱柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了,基本原理,大分子物

33、质在凝胶颗粒间隙中运动小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质结果使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。,分离过程,凝胶色谱介质,理想的凝胶过滤介质具有高物理强度及化学稳定性，能够耐受高温高压和强酸强碱，具有高化学惰性，内孔径分布范围窄，珠粒颗粒大小均一度高。凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。目前，常用的有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。,凝胶色谱分离具有工艺简

34、单、操作方便、分离回收率高、实验重复性好等特点，适用于水溶性高分子物质的分离。尤其是不会改变样品生物活性，特别适合蛋白质、核酸、激素、多糖等的分离纯化。2、离子交换色谱 离子交换色谱是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行 这是目前各种色谱中应用最为广泛的技术。,基本原理,带电物质因电荷力作用而在固定相与流动相之间分配得以相互分离。蛋白质是两性电解质。当 pH pI时，蛋白质带净负电荷。由于各种蛋白质等生物大

35、分子的等电点不同，可以通过改变溶液的pH和离子强度来影响它们与离子交换树脂的吸附作用，从而将它们相互分离开来。,生物活性物质都有亲和作用，如酶与底物、激素与受体、核酸的互补链间，多糖与蛋白质复合体。亲和层析是利用生物大分子的特异亲和力而设计的层析技术。可逆结合的特异性物质称为配基，与配基结合的层析介质称为载体。亲和层析能从粗提液中，通过一次简便处理，便可得到高纯度的活性物质，既可分离一些生物材料中含量极微的物质，又能分离一些性质十分相似的物质。,3、亲和色谱分离,七、干 燥,干燥：是从湿的固体生物药物中，除去水分或溶剂而获得相对或绝对干燥制品的工艺过程。工业上从生物培养液或提取反应液中去除大部

36、分的水分，主要有两个方法：机械法和加热法,1、干燥的过程 湿物料的干燥过程分为两个阶段：第一阶段：湿物料表面受热，温度升高，表面的水分蒸发；第二个阶段：热量向物料内部传递，内部的水分向表面扩散。干燥速率：在干燥过程中，单位时间内单位面积上汽化的水分量。,干燥的过程也是加热的过程。按照加热方式的不同，干燥分为接触、对流、和辐射等几种主要类型。2、喷雾干燥 将液体通过喷射装置喷成雾滴后，在一定流速的热气流中，迅速蒸发干燥的方法。喷雾干燥的特点：干燥时间短、干燥温度低、产品质量好，易溶解。,3、冷冻干燥 冷冻干燥就是把含有大量水分物质，预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使水蒸汽直接升华出来，

37、而物质本身剩留在冻结时的冰架中，因此它干燥后体积不变，疏松多孔在升华时要吸收热量。引起产品本身温度的下降而减慢升华速度，为了增加升华速度，缩短干燥时间，必须要对产品进行适当加热。整个干燥是在较低的温度下进行的。,制品的冷冻干燥过程包括冻结、升华和再干燥3个阶段。冻结先将欲冻干物料用适宜冷却设备冷却至2左右，然后置于冷至约一40(1333Pa)冻干箱内。关闭干燥箱，迅速通入制冷剂，使物料冷冻，以克服溶液的过冷现象，使制品完全冻结，即可进行升华。升华制品的升华是在高度真空下进行的，在压力降低过程中，必须保持箱内物品的冰冻状态，以防溢出容器。待箱内压力降至一定程度后，再打开罗茨真空泵(或真空扩散泵)

38、，压力降到133Pa，一60。C以下时，冰即开始升华，升华的水蒸气在冷凝器内结成冰晶。为保证冰的升华，应开启加热系统，将搁板加热，不断供给冰升华所需的热量。,再干燥在升华阶段内，冰大量升华，此时制品的温度不宜超过最低共熔点，以防产品中产生僵块或产品外观上的缺损，在此阶段内搁板温度通常控制在10之间。制品的再干燥阶段所除去的水分为结合水分，此时固体表面的水蒸气压呈不同程度的降低，干燥速度明显下降。在保证产品质量的前提下，在此阶段内应适当提高搁板温度，以利于水分的蒸发，一般是将搁板加热至3035C，实际操作应按制品的冻干曲线(事先经多次实验绘制的温度、时间、真空度曲线)进行，直至制品温度与搁板温度

39、重合达到干燥为止。,第二节 血液制品,什么是血液？,简称血。人或高等动物体内循环系统中的液体组织，暗赤或鲜红色，有腥气，对维持生命起重要作用。,血 浆,血细胞,白细胞,红细胞,血小板,（45%）,（55%）,水：91-92%,固体成分：8-9%,各种蛋白质、无机盐、脂类、内分泌激素、维生素等,血液,血液的功能,红细胞：携带O2和CO2。白细胞：防御功能（杀灭病原体，排斥外来异物）。血小板：血液凝固功能（止血作用）。血 浆：运送营养物质和代谢物，参加调节体温和维持酸碱平衡。,人体内的血液量大约是体重的78，如体重60公斤，则血液量约42004800毫升。各种原因引起的血管破裂都可导致出血，如果失

40、血量较少，不超过总血量的10，则通过身体的自我调节，可以很快恢复；如果失血量较大，达总血量的20时，则出现脉搏加快，血压下降等症状；如果在短时间内丧失的血液达全身血液的30%或更多，就可能危及生命。,血液制品：由健康人的血浆或特异免疫人血浆分离，提纯或由重组DNA技术制成的血浆蛋白组分或血细胞组分制品，如人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子（天然或重组的）、红细胞浓缩物等，用于诊断、治疗或被动免疫预防。血液制品属于生物制品范围，主要指以健康人血液为原料，采用生物学血液制品工艺或分离纯化技术制备的生物活性制剂。,血液制品的定义,血液制品的优点,血液制品是在临床输血的基础上发展起来的，它通过将血浆

41、中的有效组分分离出来并用于治疗，较好地解决了全血不易运输和大量长期贮存中的问题。,血液制品按其组成成分可分为:全血、血液成分制品、血浆蛋白制品等。1、全血 全血，医学术语。将人体内血液采集到采血袋内所形成的混合物称为全血，即包括血细胞和血浆的所有成分。国际上一般以450毫升全血为1单位，我国则以200毫升为1单位，也分有300毫升和400毫升包装。,2、血液成分制品,成分输血：就是将血液中的有效成分分离出来，分别制成高浓度、高纯度的血液制品，然后根据患者情况，需要什么成分就给输注什么成分的输血方法。常用的血液成分制品有：红细胞制剂、白细胞制剂、血小板制剂和血浆制剂等。,（1）红细胞制剂红细胞悬

42、浮液：将采集好的全血中大部分血浆在全封闭的条件下分离出来，再向剩余物中加入适量的红细胞保存液，制成的混合物即为红细胞悬液。去白细胞红细胞悬浮;将采集好的全血中大部分白细胞、血小板及血浆在全封闭的条件下分离出来，再向剩余物中加入适量的红细胞保存液，制成的混合物。,洗涤红细胞：采用物理方式在无菌条件下将保存期内的全血、浓缩红细胞、悬浮红细胞制品用大量0.9%的生理盐水洗涤，去除绝大部分非红细胞成分，并将红细胞悬浮在适量的0.9%生理盐水中，该混合物称为洗涤红细胞。冻融去甘油红细胞：一般是用采集6天内的红细胞，加入甘油作为防冻剂，在-80或-196下保存5-10年，使用时融化，尽可能去除防冻剂、上清

43、血红蛋白及血浆、白细胞、血小板。一般红细胞可回收80%，需24小时内输注。由于这种方法红细胞保存时间长，可用于保存稀有血型红细胞。,（2）白细胞制剂临床上白细胞制剂主要是浓缩白细胞。浓缩白细胞的输注实际上是应用其中的中性粒细胞，发挥其细胞吞噬作用和杀菌能力，提高机体的抗感染能力。（3）血小板制剂机采血小板：采用血液单采机在全封闭的条件下，自动将全血中的血小板分离出来，悬浮于一定量的血浆内，这样制成的混合物称为机采血小板。储存于20-24的环境，震荡保存24小时至5天。,冰冻血小板：是将采集后的血小板，在净化间无菌条件下缓慢加入适量冰冻剂，装在冰冻盒中，放入-80摄氏度的低温冰柜中保存。（4）血

44、浆制品新鲜冰冻血浆：全血采集6小时内，将血浆分离出来，冰冻，这样制成的血液成分称新鲜冰冻血浆。可-20保存一年。普通冷冻血浆,冷沉淀：冷沉淀是新鲜冰冻血浆在1-5条件下不溶解的白色沉淀物，其被加热至37时呈溶解状态，主要含有第因子、纤维蛋白原、血管性血友病因子、第因子及纤维蛋白等成分。新鲜液体血浆：保存期内的抗凝全血在4-6摄氏度条件下经离心后分出血浆，24小时内输注，即为新鲜液体血浆。,3、血浆蛋白制品,免疫球蛋白：是具有抗体活性的球蛋白，它也是人血清电泳移动最慢的部分，即丙种球蛋白。它们是分子量不等而结构极为相似的集合体。分为标准免疫球蛋白，静脉注射用免疫球蛋白，特异性免疫球蛋白。人血白蛋

45、白：是临床常用的血浆容量扩张剂之一，它是从健康人血浆中提取分离制得的，10以下可保存5年。,二、血液制品的生产技术,人血白蛋白 人血白蛋白是血浆中含量最高的蛋白，占血浆蛋白的60%左右。目前国际上主要采用低温乙醇法分离血浆蛋白。此法最初由Cohn教授于1946年开发成功，当时称Cohn6法。此后许多学者提出了多种改良方法，最有价值的是Nitschman等提出的经改良的低温乙醇分离血浆的方法，简称N-K法。,血浆,上清液,上清液+,沉淀,沉淀+（用于分离免疫球蛋白）,乙醇：8%，PH：7.23，N：5.0%,乙醇：19%，PH：5.85，N：4.5%,上清液,沉淀,血蛋白制品,上清液（废弃）,乙

46、醇：40%，PH：5.87，N：2.5%,乙醇：40%，PH：4.88，N：2.0%,NK法分离人血白蛋白的工艺（N表示蛋白质浓度）,1、原料血浆的采集及准备 为了保证血浆蛋白制品的安全，必须确定供血浆者的健康状况、体检标准、免疫要求等等，避免导致疾病的传染。对于合格的献血者来说，血浆的采取每次不得多于580ml,采浆间隔不得短于2周。每个供血者的采浆量每年应少于12000ml，每月应少于1200ml。,乙肝表面抗原（HBsAg）是乙肝病毒的外壳蛋白，本身不具有传染性，但它的出现常伴随乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的标志。它可存在于患者的血液、唾液、乳汁、汗液、泪水、鼻咽分泌物、精液及

47、阴道分泌物中。在感染乙肝病毒后26个月，当丙氨酸氨基转移酶升高前28周时，可在血清中测到阳性结果。急性乙型肝炎患者大部分可在病程早期转阴，慢性乙型肝炎患者该指标可持续阳性。,丙型肝炎由丙型肝炎病毒（HCV）感染所致，主要由血液/体液传播。据世界卫生组织估计，全球有1.7亿人感染HCV。在我国健康人群抗HCV阳性率为0.7%3.1%，约3800万人。由于病毒生物学特点和宿主免疫功能等多方面因素，机体免疫往往难以有效清除病毒，致使约50%80%HCV感染者发展为慢性肝炎，其中20%30%将发展成肝硬化。肝硬化患者中每年有1%4%发展成为肝细胞癌症。,2、原料血浆的储存和运输 血浆采集后应在6h内冻

48、结，-20以下保存。冻结后的血浆应在-15以下运输。低温冷冻保存血浆最长不应超过2年。3、生产用水和化学药品 生产用原水应符合国家饮水标准，直接用于制品的水应符合注射用水标准。所用各种化学药品应符合中华人民共和国药典,4、分离人血白蛋白（1）融化血浆 将冷冻血浆外袋清洗、消毒后，去除外袋，去掉外袋的冷冻血浆通常放在夹层罐中融化，夹层中通入40以下温水，融化时间越快越好。（2）分离蛋白 根据蛋白溶解度不同可将目标蛋白与血浆中的其他蛋白分离开，另外要确保蛋白生物活性不受损失或尽量少受损失。,影响沉淀蛋白效果的因素：酸碱度、温度、乙醇浓度、蛋白浓度、溶液离子强度。（1）酸碱度：选择溶液中各种蛋白成分

49、的等电点来沉淀蛋白。（2）温度：温度降低时，可以防止蛋白“变性”；减少蛋白分子的溶解度，促进蛋白沉淀；减少乙醇的挥发，提高安全性，因此分离蛋白选择较低的温度。（3）乙醇浓度：操作过程中要严格控制乙醇浓度，以达到分离不同蛋白的目的。,低温乙醇沉淀技术生产的白蛋白较安全，是目前血浆白蛋白制品生产的首选工艺。这是因为：生产过程中潜在污染病毒相对集中到往往被废弃或经进一步处理而灭活的其他成分中；乙醇对多种已知病毒杀灭作用；制备中的冻融过程对病毒有杀灭或破坏作用。优点：沉淀剂乙醇的化学性质稳定，不易与蛋白发生化学反应，毒性低，污染小，价格低廉，能抑制细菌生长，控制热原，对病毒有极强的杀灭作用。,6、超滤

50、脱醇、浓缩、除铝 目前，人血白蛋白的生产中，脱醇一般采用超滤法。例如人血白蛋白脱醇可选用截留相对分子质量为8000或10000的超滤膜。乙醇的相对分子质量为46.07，而人血白蛋白的相对分子质量为66000.采用透析的方法，减少原始血浆中AI3+含量。7、半成品配制 对已经纯化的蛋白溶液中要加入适量的稳定剂，防止制品在制备、储存、运输过程中发生变性、失活、解离或聚合。稳定剂为辛酸钠（辛酸钠和乙酰色氨酸钠共用）,8、病毒灭活 目前常用的病毒灭活方法有：（1）湿热灭活法 1948年起，已将60、10h的巴氏灭活法成功地用于人血白蛋白，简称“巴氏法”。但该方法对某些血浆蛋白，特别是对热不稳定蛋白有一