生化工程课程串讲.ppt

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1、生化工程 课程串讲,第二章 培养基灭菌,第一节 分批灭菌ln(N/N0)=-K t,ln(N/N0)=-K t ln(C/C0)=-Kd t,杂菌,营养物质,T，K，Kd也就是K对T的变化率是怎么样的？,灭菌动力学的重要结论,细菌孢子热死灭反应的E很高，而大部分营养物质热破坏反应的E很低，因而将T提高到一定程度会加速细菌孢子的死灭速率，从而缩短在升高温度下的灭菌时间（ln(N/N0)=-K t）；由于营养成分热破坏的E很低，上述的温度提高只能稍微增大其热破坏温度，但由于灭菌时间的显著缩短，结果是营养成分的破坏量在允许的范围内。,2、分批灭菌的设计 要求绝对的无菌在工业上很难做到，因为：,N=0

2、，则e-kt=0,1/ekt=0,ekt=,t=,因此，绝对的无菌很难做到。,第一节 分批灭菌 二 分批灭菌的设计,分批灭菌过程：升温、保温和降温，灭菌主要是在保温过程中实现的，在升温的后期和冷却的初期，培养基的温度很高，因而对灭菌也有一定贡献。,Ln(N1/N2),Ln N0/N=36.8是总的判据，是由升温、保温、降温三段实现的,ln（N0/N）=ln（）,ln N0/N,=ln,+ln,+ln,第二节 连续灭菌,一、连续灭菌方法与间歇灭菌相比，连续灭菌的优点：1 升温和降温速度快2 灭菌温度高，保温时间短3 蒸汽用量平稳缺点：1 设备复杂，投资大。,返混现象：反应器中停留时间不同的物料之

3、间的混合称为返混。按照返混的程度，在化学工程中建立了两种理想的连续流动反应器模型。连续搅拌罐（CSTR）和活塞流反应器（PFR）反应器,返混为,返混为零,第二节 连续灭菌（1）PFR模型（活塞流模型）plug flow reactor,恒温热灭菌状况：1 同一截面上活孢子浓度（N）相等，热死灭速率相等。2 沿流动的方向，活孢子浓度（N）下降，热死灭速率也相应下降。,第二节 连续灭菌（4）扩散模型,返混：是不同反应时间的物料之间的混合。PFR：返混程度最小CSTR：返混程度最大高/径，返混程度高/径，返混程度 实际操作的大部分反应器都介于这两种理想的反应器之间。,第三章 空气除菌,1、空气除菌的

4、目的及重要性 在好氧深层培养中，微生物细胞的繁殖代谢需要溶解氧，因为有氧氧化对生物体来说是能量放出最多的途径。在该过程中脱去了很多H，H经电子传递链，最后被O2吸收，所以要提供氧。现在深层培养都是纯种培养，培养基接种之前都经过灭菌，通入的氧气也应是无菌的。,第三节空气过滤设计,空气过滤器使用的过滤介质，按其孔径大小可分为二类：1)绝对过滤介质：绝对过滤介质的孔隙小于细菌和孢子，当空气通过时微生物被阻留在介质的一侧。2)深层过滤介质：深层过滤介质的截面孔隙大于微生物，为了达到所需的除菌效果，介质必须有一定的厚度，因此称为深层过滤介质。,一、深层过滤原理,1、惯性冲撞机制（1）（大颗粒）气流中运动

5、的颗粒，质量，速度，具有惯性，当微粒随气流以一定的速度向着纤维垂直运动时，空气受阻改变方向，绕过纤维前进，微粒由于惯性的作用，不能及时改变方向，便冲向纤维表面，并滞留在纤维表面。1,式中：微粒密度：空气粘度 V：微粒流速 dp：微粒直径 df：纤维直径 C：修正系数,2、阻截（截留）机制（2）（小颗粒）,阻截机制对阻截小颗粒比较有效。细菌的质量小，紧随空气流的流线前进，当空气流线中所携带的颗粒和纤维接触时被捕集。截留微粒的捕集效率几乎完全取决于微粒的直径，和气流速度关系不大。,2=,NR=,NRe=dfu/,3、布朗扩散机制,平均自由程,M：气体分子量；：气体密度。,V,3,二、深层过滤计算,

6、要解决的问题是：处理空气量为Q时，含菌个数No的空气要达到N=10-3，需要的介质层厚度L=？,Q0，N0,Q，N,那么 与 L 的关系怎样？有学者作了实验：测定 与L之间的关系。,ln,L,Slope=K,ln,=-KL,对数穿透定律：,L：滤床厚度、K：与纤维捕集效 率有关的系数,第四节 其它空气灭菌方法,1 热灭菌法2 射线杀菌3 静电除菌,第四章 通气与搅拌,三、影响微生物需氧量的因素1.碳源种类 碳源种类不同，利用速度不同。C6H12O6+6O26H2O+6CO22.碳源浓度 与碳源浓度是否成为限制性有关,3.培养条件(pH、T)pH、T 影响生长速率和产物生成速率。4.(有害)代谢

7、产物 抑制细胞呼吸作用。5.培养时期的影响 不同时期微生物生命活动能力不同。注意：溶解氧浓度对细胞生长和产物生成的影响可能不同。,二、气体溶解过程的双膜理论 1.气液两相间存在稳定的相界面，界面两侧各有一层有效膜，溶质(氧)以分子扩散的传质方式由气相主体进入液相主体。2.在相界面处，气液两相达到平衡。3.在气、液两相主体中，溶质(氧)浓度均匀。过程：氧 由气相气液界面液相,气膜,液膜,p,pi,p-pi,Ci-CL,气膜,液膜,气液界面,Ci,CL,氧分压pi和氧浓度Ci难测定，改用总传质系数KG或KL和总推动力。则，在稳定传递状态时，,p*：与液相氧浓度CL平衡的氧分压；C*：气相中氧分压P

8、 达平衡时的氧浓度；KG：以氧分压差为推动力总传质系数；KL：以氧浓度差为推动力总传质系数；,其中，kG或kL与KG或KL的关系，可根据亨利定律来求得，即：,三、氧传质方程式 采用体积溶氧系数或体积传质系数：KLa(或KGa)，据此氧传质(溶氧速率)方程可表示为：,4-3 影响氧供给的因素 根据气液传质速率方程式：,可知：凡影响推动力(C*CL)或(pp*)、比表面积a和传质系数KL的因素，都会影响氧传递速率。,一、影响推动力的因素1.温度 氧是气体，它在水中的溶解度随温度升高而降低。在常压、4-33内，纯水中氧的浓度CW*为：,2.电解质 盐析作用可降低氧的溶解。在电解质溶液中，有如下关系式

9、：,：氧在水的溶解度；mol/M3：氧在电解质溶液中的溶解度;mol/M3：电解质溶液的浓度；kmol/M3K：Sechenov常数；,3.非电解质 在非电解质溶氧中，氧的溶解度随溶质浓度增加而降低，其规律类似于电解质溶液：,：氧在非电解质溶液中的溶解度；：非电解质中溶质的浓度或有机物浓度；,4.氧分压(1)增加罐压 提高罐压可提高氧分压。(2)提高空气中氧的含量(富氧通气)a.深冷分离 b.吸附分离 c.膜分离(3)提高H/D,二、影响KLa的因素 KLa是a与KL合并作为一个参数，实际中影响该参数的因素有：(一)操作条件1.搅拌A.搅拌的作用：(1)打碎，防合并，增大气液接触面积；(2)产

10、生涡流，螺旋，延长停留时间；(3)产生湍流，减厚度，降阻力；(4)均匀混合，利吸收和积累；,B.搅拌器(1)型式：旋桨式，轴向推动；涡轮式，径向推动，形成上下两个翻动；后者常被采用。多组时，上常为平桨式，下常为涡轮式；(2)转速n和直径d：影响溶氧水平和混合程度。PH搅Q搅n3d5，搅拌循环量Q搅nd3，H搅n2d2；增加n对提高溶氧有利，增加d对均匀混合有利。,(3)间距(相对位置)：太大，产生搅拌死角；太小，相互干扰；因流体力学性质不同而有所差别，牛顿型:d=(3-4)D，非牛顿型:d 2D；(4)位置(距罐底的距离)：h太大，最底部液体难提升，造成局部缺氧。太小，造成功率损失。一般为：(

11、0.8-1)d。(5)组数：确定与H/D有关，综合考虑溶氧和功率消耗等因素。,2.通气的影响,对特定发酵罐，、是定值。随 增加,增加；增加，增加。影响、的因素可以影响KLa值，与罐的形状、结构有关，随罐径增加而降低。,通气表观线速度,(二)液体性质的影响(1)液体密度：(2)粘度：(3)表面张力：(4)扩散系数DL：综上所述，影响可归纳为：,(三)其它因素的影响(1)表面活性剂：定向排列；(2)离子强度：KLa比水大(见图1)；(3)细胞浓度：非牛顿型增加(见图2)；,溶质浓度(g/L),X,图1,图2,4-4 溶氧系数的测定（Kla）,化学方法：亚硫酸盐氧化法,极谱法,电极法,取样,排气,一

12、、亚硫酸盐氧化法二、极谱法三、复膜电极法四、氧平衡法 它们的作用原理：,第5章 生物反应器的比拟放大,一般说来，菌种的接入方式、菌龄、接种量、培养基组成、加料方式、pH值、操作温度、罐压、溶氧速率、搅拌混合强度等因素，都不同程度地影响细胞的反应过程。,5.1 几何尺寸放大,在反应罐的放大中，放大倍数实际上就是罐的体积增加倍数。放大倍数 m=V放大/V模型一般要保持几何相似的原则，那么 H1/D1=H2/D2=A(常数)V2/V1=(D2/D1)3=m D2/D1=m1/3(H2/H1)3=m H2/H1=m1/3,5.2 空气流量放大,生物反应中空气流量一般有两种表示方法：1以单位培养液体积在

13、单位时间内通入的空气量VVM（标准状态）来表示（m3/m3 h）2以操作状态下的空气直线速度Vs表示，m/min两种空气流量表示方式可以换算。,整理出:(VVM)=(VVM),Vs1 PLD2,27465.6 VL(273+t),m3/m3 min,标准状态,下面讨论三种空气流量的放大方法:(1)以单位培养液体积中空气流量相同的原则放大：(vvm)1=(vvm)2 Vs(vvm)VL/PD2(vvm)D/P,Vs1 PLD2,VL,Vs2,Vs1,=,D2,D1,P1,P2,Vs2,可求,(2)以空气直线流速相同的原则放大:VS1=VS2,(VVM)2,(VVM)1,=,P 2,P 1,D 2

14、,D 1,(,)2,VL1,VL2,=,P 2,P 1,D 1,D 2,(VVM)2可求。因为V2/V1=(D2/D1)3,（3）以 KLa 值相同的原则放大,Kd=(2.36+3.30Ni)(Pg/V)0.56Vs0.7N0.710-9式中有Pg、N等未定参数。可考虑用其它经验式，如Kla（）（HL）2/3 最后推导出：,Q,VL,（VVM）2,（VVM）1,=,（）2/3,D 1,D 2,P 2,P 1,5.3 搅拌功率及搅拌转数的放大,搅拌功率以及搅拌转数放大的方法很多，用于发酵罐的三种放大方法如下：（1）以单位体积培养液所消耗的功率相同原则放大(Po/V)1=(Po/V)2 Rem=1

15、04-106,Np 不变功率准数：Np=Po/(N3D5)PoN3D5VD3因此 Po/VN3D2，(N3D2)1=(N3D2)2 确定转数 N2=N1(D1/D2)2/3（P0）2/（P0）1=(N2/N1)3(D2/D1)5 下标1是模型罐，下标2是放大罐。,（2）以单位培养液体积所消耗的通气功率相同原则放大 此时(Pg/V)1=(Pg/V)2 Po=NpN3D5Np:功率准数 Rem 104 时Np趋于常量 PoN3D5根据Michel 计算 Pg的公式Pg=C(Po2ND3/Q0.56)0.45,Pg(N3D5)2 ND3/(D2Vs)0.560.45 N3.15D5.346/Vs0.

16、252Pg/V=N3.15D2.346/Vs0.252 N2/N1=(D1/D2)0.745Vs2/Vs10.08 Pg2/Pg1=(N2/N1)3(D2/D1)5=(D2/D1)2.756Vs2/Vs10.24,下标1为模型罐，下标2为放大罐,（3）以体积传质系数KLa相等的原则放大 由于气液接触过程中，传质系数的关联式较多，以福田秀雄的关联式为放大基准 Kd=(2.36+3.30Ni)(Pg/V)0.56*Vs0.7*N0.7*10-9,KLa(Pg/V)0.56Vs0.7N0.7因Pg/V N3.15 D2.346/Vs0.252KLa N2.45 Vs0.56 D1.32按(KLa)2

17、=(KLa)1 原则N2=N1 Vs1/(Vs)20.23(D1/D2)0.533(pg)2=(pg)1Vs2/(Vs)10.067(D2/D1)3.667,第六章 连续培养的基本原理 微生物的生长一般分五个阶段各段微生物所呈现状态的原因,迟缓期（适应期）对数生长期减速期静止期（平衡期）衰退期（死亡期）,在微生物培养过程中，菌体浓度的生长速率是菌体浓度、基质浓度和抑制剂浓度的函数，即 dx/dt=f(X.S.I)以上两式表明菌体浓度的增长速率与培养液中菌体浓度成正比。,比生长速率的意义：比生长速率就是菌体生长速率与培养基中菌体浓度之比，它与微生物的生命活动有联系。在对数生长期，是一个常数，这时

18、,（2）无抑制的细胞生长动力学 Monod方程,理解并讨论公式细胞的比生长速率与限制性基质浓度的关系可用下式表示：,3、营养物质对生长的影响,所有营养物质均存在一上限浓度，超过此限，反而会引起生长速率的下降。这种效应称为基质抑制作用（高渗透压作用）。另外，某些代谢产物也能抑制生长。其反应方程式为：Kp为经验常数；P为代谢产物浓度,第二节 连续培养动力学及连续培养的应用,2、单级恒化器生产率与分批发酵生产率的比较连续培养的生产率为：P=DX得,连续培养的最大生产率,对（）求一阶导数并使其为零，计算出：,Pc与Pb的比较（分批培养与连续培养）,限制性基质为碳源时，部分消耗的碳源作为能量供生命活动，

19、X偏低；N，S为限制性基质，D较小时会积累多糖，脂肪等，X偏高；Mg,P,K为限制性基质时，同上，但细胞内这些物质下降，YX/S增大，细胞浓度偏高；复合培养基时，情况复杂，随着变化，限制性基质会改变，X下降。,连续培养结果与正常情况发生偏差,第七章 固定化细胞和酶7.1 固定化方法及固定化后酶和细胞的性质,一、固定化的原则和方法由于酶催化作用依靠它的高级结构及活性中心。固定化时，活性中心的必需基团避免参加反应；避免高温、强碱、有机溶剂以及高浓度盐的处理，保护靠氢键、离子键、疏水键等弱键维系的酶蛋白质的高级结构。尽可能在温和条件下进行固定化反应。,固定化方法：,载体结合法：将酶（细胞）固定在不溶

20、性载体上。靠共价结合、离子结合、和物理吸附。常用的载体：纤维素、葡聚糖、琼脂糖等多糖衍生物颗粒或多孔玻璃等。,载体结合法交联法包埋法,8.1 固定化方法及固定化后酶和细胞的的性质,交联法：使酶与具有两个以上官能团的试剂（戊二醛）进行反应，应用化学键把酶固定。,包埋法：将酶包在凝胶微小格子内，或是将酶包裹在半透性聚合物膜内的固定化方法。常用的凝胶为聚丙烯酰胺、海藻酸钙、胶原、卡拉胶等。包埋法简单，可适用于大多数酶。,2、稳定性 酶或细胞被固定化后，由于载体的存在，酶分子的结构或细胞被约束，对外部恶劣环境的敏感性下降，使其稳定性增加（对热、对各种化学试剂等）。而且有时稳定性增加的幅度比较大。,3、

21、催化活性（底物专一性，反应的pH值，T，动力学常数）,a.底物专一性：当底物为大分子时，酶或细胞对底物专一性下降；当底物为小分子时，酶或细胞对底物专一性变化不大。,b最适pH：依固定化载体与酶分子、细胞上所分布电荷的相互作用不同而异。有的变化，有的不变化，有的向pH小的方向移动，有的向pH大的方向移动。,3、催化活性（底物专一性，反应的pH值，T，动力学常数）,c.反应的最适温度 固定化酶、细胞的最适温度往往升高，升高的幅度不同，215 oC不等。,d.动力学常数 酶：米氏常数km反映了酶和底物的亲和力。固定化酶的表现Km(app)与游离酶的Km相比有些不变，有的变化很大。,固定化酶和细胞技术

22、的显著特点：1连续反应；2获得的产物纯度高；3固定化酶或细胞可重复使用，减少 了浪费；4易实现自控。,底物从反应液移向载体表面（外扩散）底物从载体表面移向酶活性中心（内扩散）酶反应产物由反应位点移向载体表面（内扩散）产物移到反应液中（外扩散）总的反应速度取决于最慢的步骤,3、扩散阻力,5、内扩散限制的分析以及对酶反应动力学的影响,内扩散限制对酶促反应动力学的影响，比外扩散更为突出，因为外扩散限制可以通过搅拌来基本消除，而内扩散限制无法消除。在固定化酶、固定化细胞的内部，不存在流体流动，其传质完全依赖于分子被动扩散作用。,定义为有效系数：=,V有,V无,有微孔内扩散效应下的反应速度,无微孔内扩散

23、效应的反应速度,5、内扩散限制的分析以及对酶反应动力学的影响,固定化酶、细胞的反应速度：V=VmSa/(Km+Sa)Sa：载体表面底物浓度是与内扩散系数有关的因子=RVm/KmDe1/R为固定化颗粒半径,表示反应器性能的重要操作参数：,空间时间转化率x生产率Pr选择率Ssp,（3）PFR和CSTR反应器的生产时间比较 为了方便比较，把操作方程改写为：,CSTR,PFR,PFR和CSTR的生产时间比较,x应在80以上。达同样的转化率，F值差别很大。而且 越小，差别越显著。,结论：PFR的停留时间小于CSTR的停留时间,转化率x愈高，Km/S0 越小时用酶量的差别越大。,反应器体积一定，达到相同转

24、化率时，ECSTR/EPFR 与转化率的比较,在给定的反应体系下，反应器中的装酶量为定值，达一定x下反应器所需酶量愈少，反应器的反应容量能力也就愈大。可见PFR的生产能力比CSTR的大。,3、固定化酶、固定化细胞反应器的操作稳定性,在使用期间，固定化酶、细胞的活性会下降，主要原因是：酶变性，细胞自消化；可能由于pH、T、毒物作用，该过程比较缓慢，而且底物往往有保护作用。吸附抑制物；染菌；酶、细胞流失；载体崩解；,第八章微生物生化反应的质量和能量衡 算,微生物反应过程的特点1.微生物反应是生物化学反应，通常是在常温、常压下进行。2.反应中参与反应的培养基成分多，反应途径复杂，因而在微生物生长的同

25、时往往还伴随着生成代谢产物反应。3.微生物反应还受到众多外界环境因素的影响。,质量和能量衡算在工程上的意义,通过衡算，可以了解反应物和生成物之间定量关系，反应过程需要消耗和释放多少能量。通过衡算式由已知量可以求出未知量。所以它是研究反应过程的一个有效手段，对解决工程问题特别有用。,一、微生物反应过程中主要基质 碳源的衡算,大部分的发酵过程中都是以糖作为碳源。在微生物中碳源主要消耗于：1、满足于微生物菌体生长的需要，可用(S)G表示。2、维持微生物生存的消耗（如菌体的运动和营养物质的摄取和代谢产物排泄等主动运输的耗能，可用(S)m3、生成代谢产物的消耗，可用(S)P 则有-S=(-S)G+(-S

26、)m+(-S)P 得率系数是对碳源等物质生成细胞或其他产物的潜力进行定量评价的重要参数。,在相同微生物不同培养条件和限制性基质情况下，微生物细胞的元素组成有些差别，但差别不大，可以看作相对稳定。根据培养基中营养物质（S），菌体（X），产物（P）和二氧化碳中含碳元素的数量可以写出微生物反应过程碳元素的衡算式：(-dS/dt)1=(dX/dt)2+(dCO2/dt)3+(dP/dt)4 1=2+QCO23+QP4：营养物质的消耗比速，=(1/X)(-dS/dt)(mol/g.h)：微生物菌体生长比速，=(1/X)(dX/dt)(h-1)QCO2：二氧化碳生成比速，QCO2=(1/X)(dCO2/d

27、t)(mol/g.h)QP：代谢产物生成比速，QP=(1/X)(dP/dt)(mol/g.h)1：每摩尔基质中碳的含量(g/mol),葡萄糖1=722：每克干菌体中碳的含量(g/g),一般1=0.5 3：每摩尔二氧化碳碳的含量（g/mol),3=12 4：每摩尔产物内碳的含量（g/mol），对乙醇4=24，对醋酸4=24，对乳酸4=36等。,二、氧和ATP衡算若为单一碳源培养基，微生物生长菌体并生成产物的条件下，按碳源和产物完全氧化所需的氧，可建立下列氧的衡算式：A(-S)=B X+O2+C P A：碳源 S 完全氧化需氧量，如葡糖:A=6(mol/mol)B：菌体 X 完全氧化需氧量，一般可

28、B=0.042(mol/g)C：代谢产物 P 完全氧化需氧量(mol/mol)，如乙醇 C=2，醋酸 C=2，乳酸 C=3 O2 是微生物反应过程中的耗氧量。它由两部分组成：维持生命活动的耗氧+生长菌体的耗氧。m0：为菌体需要的氧的维持常数（mol/g.h)若以X为培养液内菌体的浓度，在t时间内维持所需的耗氧量应为：m0.X.t。,O2=m0.X.t+X/YGO 忽略代谢产物可得：A(1/X)(-S/t)=B(1/X)(X/t)+(1/X)(O2/t)即：A=B+QO2 QO2：氧的消耗比速（mol/g.h)QO2=(1/X)(O2/t)=(1/X)(m 0.X+X.1/YGO)=m0+/YG

29、O,微生物反应耗氧量的计算,根据氧衡算可以估计微生物反应的耗氧量。O2=m0.X.t+X/YGO X=(O2-m0.X.t)YGO A(-S)=BX+O2+CP 当P=0 X=A(-S)-O2/B 消去 X 并进行整理得到：O2/t=A/(1+BYGO)/(-S/t)+m0.B.YGO/(1+BYGO).X p181设 a=A/(1+BYGO)b=m0.B.YGO/(1+BYGO)。式中均为常数物理意义：a-与碳源完全氧化耗氧相当的菌体生长的需氧量。（mol/mol,g/g)b-微生物菌体维持代谢的氧的消耗比速（mol/g.h,g/g.h)O2/t=a(-S/t)+b.X 或是 QO2=a+b

30、,三、微生物反应过程的ATP衡算,对于ATP 衡算，用碳和氧衡算相似的形式表示：(ATP)s=(ATP)m+(ATP)G(ATP)s-碳源分解代谢所形成的 ATP 数量(ATP)m-用于微生物菌体维持生命活动的 ATP 消耗(ATP)G-用于合成菌体所消耗的 ATP。mA-ATP的维持常数，则菌体X 在t 时间内 ATP 的维持消耗应为 mA.X.t YATP-ATP 对菌体生长的理论得率，则(ATP)G=X/YATP 上式又可以写成：(ATP)s=m A.X.t+X/YATP 或：(ATP)s/(X.t)=mA+/YATP=QATP QATP-碳源分解代谢产生 ATP 的生成比速,谢谢大家！,