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1、生物分离技术综合实验植物色素提取、分离及定量与初步鉴定,实验一、植物色素的制备一、实验目的:了解有机溶剂提取目的物质（植物色素）的过程与注意事项。并了解目的物质提取过程中的主要影响因子及其相互关系。二 实验原理：用有机溶剂法从原料中提取黄酮类成分,利用黄酮类物质在热乙醇中溶解度较高,将其提取出。,实验一、植物色素的制备,三、仪器高速干粉粉碎机、恒温水浴锅、烧杯试管若干、中低速离心机、过滤装置（漏斗和滤纸），250ml磨口椎形瓶6个/每组；10ml容量瓶4个/组。四、试剂配40%（80ml/组）、70%（450 ml/组）的乙醇，10硝酸铝溶液50ml/组，5亚硝酸钠50 ml/组,质量分数4.
2、3氢氧化钠200 ml/组。,实验一、植物色素的制备,五、操作1、不同浸提剂浓度对黄酮提取率的影响1.1取干粉原料15克，分成6组（2.5克每组），用8倍体积（指料液比v/m为8：1）即20ml的40%、70%，95%的乙醇浸提（温度70，时间1.5h），浸提时每隔15 min用手轻摇2min。浸提所得粗液进行离心（4500r/min20min），得浸提上清液。1.2 精密吸取上清液1.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加质量分数5亚硝酸钠0.4 mL，放置6 min后，加质量分数10硝酸铝0.4 mL，放置6 min，再加质量分数4.3氢氧化钠4 mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置15 m
3、in，在510nm波长下测得其吸光度值，得出最优的浸提剂浓度。（按三个水平，每个水平做两组操作，即每个单因素条件得六个数据。）,实验一、植物色素的制备,2、不同浸提时间对黄酮提取率的影响2.1 取干粉原料15克，分成6组（2.5克每组），用按8：1（指料液比v/m）的70%乙醇浸提（温度70），浸提时间分别为90min、120min，150min，浸提时每隔15分钟用手轻摇2min。浸提所得粗液进行离心（4500r/min20min），得浸提上清液。2.2 精密吸取上清液1.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加质量分数5亚硝酸钠0.4 mL，放置6 min后，加质量分数10硝酸铝0.4 m
4、L，放置6 min，再加质量分数4.3氢氧化钠4 mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置15 min，在510nm波长下测得其吸光度值，得出最优的浸提时间。（按三个水平，每个水平做两组操作每个水平做两组操作，即每个单因素条件做六个数据。）,实验一、植物色素的制备,3、不同料液比对黄酮提取率的影响3.1 取干粉原料15克，分成6组（2.5克每组），用按6：1，8：1，10：1（指料液比v/m，即ml/克）的70%乙醇浸提（温度70，时间1.5h），浸提时每隔15分钟用手轻摇2min。浸提所得粗液进行离心（4500r/min20min），得浸提上清液。3.2 精密吸取上清液1.0 mL，分别置于10 m
5、L容量瓶中，加质量分数5亚硝酸钠0.4 mL，放置6 min后，加质量分数10硝酸铝0.4 mL，放置6 min，再加质量分数4.3氢氧化钠4 mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置15 min，在510nm波长下测得其吸光度值，按V*A值的大小比较得出最优的料液比。选做部分：若出现从6：18：110：1的（V*A）持续平稳增加，则可以继续加大料液比（可以为12：1，14：1,）,直到找到拐点位置的最佳料液比。,实验一、植物色素的制备,六、实验注意事项1、将本实验中所有的乙醇提取的浸提液集中起来（一定要记下这些浸提液所对应的原料质量M），量取其总体积V，将提取液分出50ml，将这50ml和其余色素液
6、分置于两个烧杯中，然后将两个烧杯在4左右的低温下并用保鲜膜封闭保存（按现在的温度，放在台子上避光保存即可），以供后面纯化实验使用。2、在色素提取过程中，每隔一段时间要进行轻摇，摇晃时幅度要小，以免使提取原料粘在壁上，造成原料损失。3、在做不同料液比对色素提取影响实验时，比较结果优劣要用V*A,即：体积*吸光度值。,实验一、植物色素的制备,六、实验注意事项4、离心前一定要认真平衡好，两管质量平衡误差应在0.1克以内。同时，在离心过程中，一定要有专人看护以免发生事故。5、实验当中的提取液一定要全部从磨口锥形瓶和离心管中倒出，在将离心好的色素倒出时，一定要小心，不要将底部的沉降物倒出来。6、色素提取
7、过程中一定要在锥形瓶上加上塞子，若乙醇蒸发较快时（如：80%以上的高浓度乙醇提取时），可以考虑在磨口锥形瓶上加一蛇形管，但低浓度乙醇提取时没有必要加蛇形管。,实验一、植物色素的制备,7、上样液的制备（该步骤亦可以在实验二中完成）将实验一中所得的所有浸提液用烧杯放在100水浴中浓缩到20ml，将所得浓缩液置于50ml（或更大的）分液漏斗中，按等量体积加入石油醚后塞上塞子并充分摇匀，弃石油醚层，得下层黄酮液，放在90水浴中浓缩，浓缩至10ml（具体操作时，可先用大烧杯进行浓缩，待溶液约50ml左右时，改用50ml小烧杯进行浓缩，这样便于进行定量），备用。,实验一、植物色素的制备,8、测量吸光度时，
8、一定要设空白对照（即把除1ml样液以外的其余9ml亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、蒸馏水+1ml乙醇）9、由于各提取液浓度较大，在测量吸光度前，一定要将待测液取出1mL，稀释到10mL后，再按前面A值测定方法进行测定。,实验一、植物色素的制备附录,1、实验前面准备（同学们不需要做）：（1）、原料的制备用高速干粉粉碎机将银杏叶粉碎，过40目以上，40-60目，60-70目，70-80目，80-90目，90-100目，100目以上，筛后备用。（2）、标准曲线的绘制：精密称取芦丁对照品200 mg，用体积分数(下同)70乙醇溶解，定容至100 mL容量瓶中摇匀。精密移取10 mL芦丁乙醇液于25 mL容
9、量瓶中，用蒸馏水定容，得到0.8 mgmL标准溶液。精密吸取标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加质量分数5亚硝酸钠0.4 mL，放置6 min后，加质量分数10硝酸铝0.4 mL，放置6 min，再加质量分数4.3氢氧化钠4 mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置15 min，进行测量，在510nm处有最大吸收波长。以测定结果得芦丁浓度与吸光度的标准曲线：Y=0.1035Ad-0.0016(Y：芦丁浓度，mgml；A：吸光值)，R=0.9999。,实验二、植物色素的分离纯化,一、目的学习掌握柱层析法分离纯化目的物质（植物色素）的方法和操作。二、
10、原理柱层析是比较理想的分离黄酮类色素的方法,其原理是通过基质分子与黄酮类化合物分子上的酚羟基形成氢键缔合物而产生作用,其作用力强弱取决于黄酮类化合物分子上羟基的数目与位置以及洗脱剂与黄酮类化合物和基质之间形成氢键缔合能力的大小。常用不同比例的水和醇混合溶剂作为洗脱剂，能成功分离各种类型的黄酮。,实验二、植物色素的分离纯化,三、器材与试剂1、实验仪器 层析柱、试管、烧杯、量筒、烘箱。2、实验试剂 石油醚、40%乙醇200ml/组、70%乙醇300ml/组、95%乙醇200ml/组、基质。3、实验材料 银杏叶提取液,实验二、植物色素的分离纯化,四、操作1、上样液的制备（该步骤亦可以在实验一中完成）
11、将实验一中所得的所有浸提液用烧杯放在100水浴中浓缩到20ml，将所得浓缩液置于50ml（或更大的）分液漏斗中，按等量体积加入石油醚后塞上塞子并充分摇匀，弃石油醚层，得下层黄酮液，放在90水浴中浓缩，浓缩至10ml（具体操作时，可先用大烧杯进行浓缩，待溶液约50ml左右时，改用50ml小烧杯进行浓缩，这样便于进行定量），备用。2、基质的的预处理：称取所需的大孔吸附树脂(湿重)，以95乙醇浸泡24 h，充分溶胀后用乙醇湿法装柱，,实验二、植物色素的分离纯化,3 装柱：将酒精浸泡好的基质约40ml（指混匀状态下取样），通过漏斗缓慢倒入柱中（柱中已经装好10ml95%乙醇），边加边用木夹子轻敲柱子，
12、同时用竹签轻轻压实。流速应控制在20滴/min，待装至20cm柱高，再加与柱壁完全吻合的滤纸片，接着加入1.0 cm高海沙（或石英砂）。（注意，在整个装柱过程中，树脂应浸泡在溶液中，否则会出现断痕，气泡等。若柱子无砂芯，要在装柱前加一小团（大拇指指甲大小的）棉花封住柱子，以防基质漏出。）4、平衡：用95%乙醇洗柱，不时检查流出的乙醇液，待流出的乙醇液与去离子水以1：3的体积比混合，振摇不显白色浑浊时结束洗柱（已洗好，不必做），用纯化水将柱中树脂洗至无醇味后备用。（注意，所有醇洗液需回收到大的烧杯里，水洗液不必回收）5、上样与吸附：取浓缩液10ml上柱，吸附20min（流速20滴/min），等样
13、品液完全流入基质中后，用3倍柱体积（约150ml）去离子水洗脱。,实验二、植物色素的分离纯化,6、洗脱（解吸附）：6.1 依次用40%200ml（流速约30滴/min）、70%300ml（流速约20滴/min）、95%200ml（流速约40滴/min）乙醇分别进行洗脱，将试管放在试管架上按序接收洗脱液，每管收集 8ml左右洗脱液6.2 从第一管起，每接收3管，则精密吸取第1、4、7、10等管中的洗脱液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加质量分数5亚硝酸钠0.4 mL，放置6 min后，加质量分数10硝酸铝0.4 mL，放置6 min，再加质量分数4.3氢氧化钠4 mL，加蒸馏水至刻度，摇匀
14、，放置15 min，在510nm波长下测得其吸光度值；,实验二、植物色素的分离纯化,6、洗脱（解吸附）：6.3 确定黄酮所在的主要流分后，将吸光度值在0.1以上（含0.1）的所有管中的洗脱液集中起来，测出其总体积V纯化（接着，可直接测定纯化液的A值），预留50ml纯化液，用保鲜膜封闭后放在4中低温保存，并将其余的纯化液置于90水浴中浓缩至10ml，用保鲜膜封闭后放在4中低温避光保存，备用。,实验二、植物色素的分离纯化,五、实验注意事项1、装柱前在柱子底部加一小棉花球。2、装柱时，边加树脂边用木质棒（或橡胶棒）轻敲柱子，使基质缓缓下沉。3、装柱要求连续、均匀、无纹格、无气泡，表面平整，整个层析过
15、程中液面一定不得低于树脂表面。4、要注意及时开启和关闭旋纽，即在上一种液体刚好没入基质时，才开始加入下一种液体，且一定要用玻棒引流。,实验二、植物色素的分离纯化,五、实验注意事项5、要注意控制流速，不宜过快。6、在加入好样品后（在洗壁前）就要接收洗脱液。7、柱子预处理时的流出液用三角瓶或烧杯接收，而上样后的色素洗脱液则用试管接收。8、所预留的纯化液50ml和10ml，必须是在所有洗脱下来的A值大于0.1的纯化液混匀后才能取液。,实验三、植物色素的定量与初步鉴定,一、目的 用化学方法鉴定上面所纯化的提取液中有黄酮存在，同时测定黄酮的含量和最后的得率。二、原理黄酮化合物分子结构中具有C5、C6位的
16、酚羟基或邻二酚羟基可与金属盐试剂铝盐生成有色络合物，黄酮络合物在510nm处有较大的吸收峰，可由分光光度法测出黄酮含量。根据黄酮的一些特性，利用黄酮与一些试剂发生特殊的发色反应来检测黄酮。,实验三、植物色素的定量与初步鉴定,三、实验器材1、实验仪器：分光光度计，烘箱，电子天平，10ml 容量瓶1支/组，100m容量瓶1支/组，移液管若干。2、实验试剂：80%的氢氧化钠（质量分数）溶液，10%的FeCl3，10%的FeCl2溶液，2%NaBH4溶液，甲醇。3、实验材料：实验二中所得的洗脱液的浓缩液（总体积为10ml）。,实验三、植物色素的定量与初步鉴定,四、实验步骤（一）物质初步鉴定操作（样液是
17、实验二中纯化液浓缩而来的10ml）：1、在所纯化的提取液2ml中加入10%的氢氧化钠（质量分数）溶液2ml，若色素液马上由黄色变为深黄色；则认定黄酮化合物的存在。2、在所纯化的提取液两份，各为2ml，分别加入10%的FeCl3，Fe Cl2；若发现两种离子都使色素溶液变为蓝绿色，则可认定黄酮化合物的存在。3、硼酸氢钠反应：取黄酮纯化液2ml，再加等量的2%NaBH4的甲醇溶液1min后加浓盐酸（买来即用，不需调配）数滴，若有紫色或紫红色出现，则说明此黄酮纯化液中有二氢黄酮存在。,实验三、植物色素的定量与初步鉴定,（二）目的物质得率的确定：1、标准曲线及方程和最佳吸收波长用实验一的结果。2、从实
18、验二所得的预留在冰箱中的10ml纯化液中精密吸取1ml，（注意，若储存液有沉降现象，则可进行40 加热，待其澄清后再进行光度测定，但若是连续实验，就不必在冰箱中保存而是在实验二中直接测定其A值），放置于10 mL容量瓶中，冰箱中取出放置一定时间，使之达到室温后，按前面方法，在510nm波长下测得其吸光度值A。此步骤亦可在实验二中直接测定。,实验三、植物色素的定量与初步鉴定,（二）目的物质得率的确定：将A样品代入标准曲线方程Y=KA+b(Y：黄酮浓度，gL；A：吸光值，用各组自己测得的方程)，可以得到待测样品的黄酮浓度，C纯化（单位为mg/ml）。C纯化=Y*10*n（由于测定浓度过程中，待测液
19、由1ml定容到10ml，n为实验过程中待测液的稀释倍数）黄酮得率%=测得的黄酮含量（mg）/原料总质量100%=（C纯化 V纯化）mg（M1000）mg100%M代表V所对应的原料的总质量。将书本公式中的“V提取液/200”去掉，因为实验二中10ml浓缩液对应的是所有提取液。,实验三、植物色素的定量与初步鉴定,（三）目的物质的纯度测定：取实验一中所得的提取液50ml，放置在已经烘干，并已经称好质量为m1的小烧杯中，放在真空干燥箱中干燥，干燥到恒重后，称其重量m2，得色素浸膏重量为（m2 m1），再根据上面第（二）中的公式算出总黄酮含量m总，则其纯度为：目的物质的纯化前纯度=C纯化50 100%
20、m2 m1,实验三、植物色素的定量与初步鉴定,（三）目的物质的纯度测定：取实验二中所得的纯化液50ml，放置在已经烘干，并已经称好质量为m3的小烧杯中，放在真空干燥箱中干燥，干燥到恒重后，称其重量m4，得色素浸膏重量为（m4 m3），再根据上面第（二）中的公式算出总黄酮含量m总，则其纯度为：目的物质的纯化后纯度=C纯化50 100%m4 m3,实验三、植物色素的定量与初步鉴定,（三）目的物质的纯度测定纯化倍数计算：m=目的物质的纯化后纯度 目的物质的纯化前纯度,实验三、植物色素的定量与初步鉴定,五、实验注意事项1、在进行目的物质得率的确定的实验中，一定要注意实验数据测量的精确性。2、在进行目的
21、物质的纯度测定的实验中，要注意色素容器（小烧杯）一定要先在高温烘干后称其重量，然后把色素倒入其内，在高温下进行烘干。,实验三、植物色素的定量与初步鉴定,五、实验注意事项3、在测定洗脱液的A值时，若洗脱液经过稀释到n倍后再测定时，则须在原来的C纯化数值的基础上在乘以稀释倍数n，在去计算相应的得率和纯度。在此情况下，测定液相当于稀释了两次，一次是样液本身的稀释，另一次是样液测定时加入的显色剂使之稀释到10倍。计算时的倍数是两次稀释倍数的乘积。4、每天的水浴锅、烘箱、水龙头、门窗等在晚上离开实验室时必须关闭。,后记,1、同学们在实验结束后，一定要将所有用过的设备洗涤干净后，摆放整齐，并归放到相应的实验室内。并把所用到的所有实验室打扫干净。2、把领用的东西由组长负责归还给老师。3、实验报告在第16周周四前交上来。,
