生物化学实验-电泳.ppt

《生物化学实验-电泳.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物化学实验-电泳.ppt（96页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、生物化学实验Biochemical Experiment,人员组成,主讲教师：吕晓玲（教授）刘常金（副教授博士）曹东旭（副教授博士）王德培（副教授博士）白小佳（讲 师博士）李昌模（副教授博士）张 燕（副教授博士）方国臻（副教授博士）实验辅助：高 辉（实验师）姚秀玲（实验师）,实验内容安排,共36学时1、生物化学实验规则及常用仪器使用入门（2学时）2、离子交换柱层析法分离氨基酸（5学时）3、3，5二硝基水杨酸法测定还原糖（5学时）4、多酚氧化酶的制备、性质及其影响因素（6学时）5、碱性蛋白酶活力的测定福林酚试剂法（4学时）6、SDSPAGE分离蛋白质（6学时）7、植物中核酸的分离与鉴定(5学时)

2、8、Bradford法测定蛋白质的含量（3学时）,1实验目的掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、纯化和测定技术的原理及方法；掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实验技能；培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作风、创新能力等综合素质。,绪论,2 通过生物化学实验应该做到,学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验。掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是各种电泳技术和层

3、析枝术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。,3.1 实验记录实验前写好实验预习报告(钢笔和园珠笔)。实验中应及时准确地记录(专用纸，事先在记录纸上设计好各种记录格式和表格）所观察到的现象和测量的数据。实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为“0.050”，而不能记成“0.05”。每个结果都要尽可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差很大，也都应如实记录，不得涂改。实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、试剂的浓度等。,3 实验记录与实验报告,3 实验记录与实验报告,3.2 实验报告实验报告的格式应为：实验目的；实验原理；仪器、材料和试剂；实验

4、步骤；结果讨论（含数理据处）；注意事项;(7)思考题 注意：实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物化学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析和见解，并欢迎对实验提出改进意见。,4 实验成绩评分方法,实验预习情况（10%）实验操作情况（20%）实验报告情况（30%）实验考试成绩（40%）,生物化学实验技术理论,层析技术,1903年，俄国科学家首创了一种从绿叶中分离多种不同颜色色素成分的方法，命名为色谱法(Chromatography)，由于翻译和习惯的原因又常称为层析法。80多年来，层析法不断发展，形式多种多样。50年代开始，相继出现了分配层析

5、、离于交换层析、凝胶层析、亲和层析、吸附层析等。几乎每一种层析法都已发展成为一门独立的生化高技术，在生化领域内得到了广泛的应用。,一、层析技术,一、层析技术,1、层析技术原理2、层析技术分类3、常用层析技术原理,1、层析技术原理,层析原理：是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。,2、层析技术分类,3、常用的层析原理,（1）分配层析纸层析原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同，在终点时达到一种平衡，其比值为一个

6、常数，即分配系数（）。固定相内溶质的浓度 流动相内溶质的浓度 固定相：滤纸上吸附的水 流动相：有机溶剂（正丁醇）,=,纸层析,纸层析是最简单的液一液相分配层析。滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时，大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此，纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相混溶的有机溶剂为层析的流动相。对某些特定化合物，在特定的展层系统，一定的温度条件下，Rf是个常数。,（2）离子交换层析,原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固定于惰性基质上，从而分离介质中的组分。常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：二乙烯苯）阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基阴离子交换剂

7、：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基 可交换离子：阳离子：Na+、H+阴离子：Cl-、OH-,示意图（交换树脂表面）,示意图（离子交换过程）,电离基团（磺酸根）,可交换离子（钠离子）,交换离子,不交换离子,示意图,水分子,（3）吸附层析,原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开，此为吸附现象。吸附现象形成的原因：吸附作用可能由几种作用力形成，包括被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间的静电引力(形成离子键)、氢键及范德华引力等。在不同条件 下，占主要地位的作用力可能不同，也可能几种力同时起作用吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉

8、、聚酰胺；滑石、陶土、粘土。,吸附层析示意图,吸附剂,易吸附分子,不易吸附分子,（4）亲和层析,原理：利用分子间具有专一亲和力而设计的层析技术。专一亲和力分子对：酶与底物、特异性抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体载体：使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。,（5）凝胶过滤,原理：被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的速度不同。物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，因此向下移动慢。凝胶物质：马铃薯淀

9、粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶。,电 泳 技 术,一.电泳的概念二.电泳技术分类三.电泳技术基本原理四.几种常见电泳方法的比较五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理,一.电泳的概念,带电质点在电场中移动的现象。,二.电泳技术分类,三.电泳技术基本原理,1.基本原理 不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带净电荷量，分子量及分子形状有关。pH pI 分子带负电荷,在电场中向正极移动;pH pI分子带正电荷,在电场中向负极移动;泳动度,2.影响电泳速度的因素,(1)电场强度泳动速度与电场强度成正比常压电泳(100500V).210V/cm，几小时或几天；蛋白质等大分子物质;高

10、压电泳(5001000V).20200V/cm，几分钟；氨基酸、小肽、核苷酸等小分子物质;（2）溶液的pH值pH距待分离物质的pI越远，泳动速度越大；（3）溶液离子强度离子强度越小,电动势越大,泳动速度越快。（4）电渗现象：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。,四.几种常见电泳的比较,五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理,1.原理 具有电泳和分子筛的双重作用2.聚丙烯酰胺凝胶的聚合单体：丙稀酰胺（Acr）交联剂：甲叉双丙稀酰胺交联剂(Bis)催化剂 聚合形成的三维网状结构。,五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理,2.聚丙烯酰胺凝胶的聚合催化剂（1）过硫酸铵-TEMED系统碱性条件下催化作用温度与聚合快

11、慢成正比（2）核黄素-TEMED系统光激发的催化反应用量少，对分析样品无影响聚合时间可自由控制,五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理,3.聚丙烯酰胺凝胶的孔径凝胶越浓T，凝胶孔径，所受阻力，机械强度丙稀酰胺浓度 分离物质分子量 4 大于100万 77.5 1100万 1530 小于1万胶的孔径为蛋白质分子平均大小一半时效果好凝胶强度的选择 先用7.5%的标准凝胶或4%-10%的凝胶梯度测试,五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理,4.缓冲系统的选择pH、离子种类和离子强度 酸性蛋白质 高pH 碱性蛋白质 低pH连续和不连续系统 电泳槽中的缓冲系统和pH 与凝胶相同 电泳槽中的缓冲系统和pH 与凝胶相同，分辨

12、率高,5.盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,（1）盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的四个不连续性A.凝胶层的不连续性 浓缩胶T=2.8 C=20%；分离胶T=7 C=2.5%B.缓冲液成分的不连续性：凝胶缓冲液Tris-HCl,含Cl，电极缓冲液Tris-Gly,GlyC.pH的不连续性：浓缩胶pH6.7,分离胶pH8.9，电极缓冲液pH8.3D.电位梯度的不连续性,5.盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,（2）盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应样品的浓缩效应电荷效应分子筛效应,A.样品的浓缩效应,缓冲液成分及pH的不连续性浓缩胶pH6.7缓冲液 浓缩胶Tris-HCl,电极缓冲液Tris-Gly解离度：Cl 蛋 Gl

13、ymclclm蛋蛋m Gly Gly凝胶中Cl为快离子，Gly为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。,缓冲液成分及pH的不连续性导致蛋白质样品浓缩效应示意图,快离子慢离子蛋白质样品,E：每厘米的电压降 EI(电流强度)/(电导率)E与电泳速度成正比电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩。,电位梯度的不连续性,E：每厘米的电压降 EI(电流强度)/(电导率)E与电泳速度成正比电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋

14、白质样品被进一步浓缩。,电位梯度的不连续性,A.样品的浓缩效应,四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：缓冲液成分及pH的不连续性电位梯度的不连续性,A.样品的浓缩效应,四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“”极向“”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。,A.样品的浓缩效应,四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“”极向“”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。,A.样品的浓缩效应,四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括

15、：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“”极向“”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。,A.样品的浓缩效应,四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“”极向“”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。,B.电荷效应,蛋白质样品进入分离胶后 pH增大(pH 8.9)，Gly解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。由于各种蛋白质pI不同，所载有效电荷不同，因此质点的 有效迁移率不同，形成不同区带。,C.分子筛效应,分离胶的孔径

16、小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的 泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。,实验一 离子交换层析法分离氨基酸,一、实验目的 学习用阳离子交换树脂分离氨基酸 的操作方法和基本原理,二、原理氨基酸的PI不同，在同一pH下所带电荷的数量和性质不同，与树脂的亲和力就有差异，因此可根据亲和力从小到大的顺序依次被洗脱下来。阳离子交换树脂：可供交换的是阳离子；阴离子交换树脂：可供交换的是阴离子；,离子交换层析法分离氨基酸,三、操作步骤,1、装柱,装柱是最关键的一步。重力沉降法装柱陆续不断地添加糊状物，使其形成的胶粒床面上有胶粒连续均匀地沉降，直至装柱物完全沉降至适

17、当的柱床体积为止。柱的表面始终要保持着一层溶剂(一般l3cm柱高)柱的任何一部分绝对不能“流干”。,1、装柱,层析柱的形状，一般直径 与高度的比为l：15为宜。柱形必须根据层析介质和 分离目的而定。待分离物 质的性质相近，柱越细长，则分离效果越好，但流速 较慢。在样品组分并不复 杂的情况下，采用“矮胖柱”。,2、平衡,层析柱正式使用前，必须平衡至所需的pH和离子强度，一般用起始缓冲液在恒定压力下走柱，其洗脱体积相当于4-6倍床体积，使交换剂充分平衡，柱床稳定。装好的柱必须均匀，无纹路，不含气泡，柱顶交换剂沉积表面十分平坦。本实验平衡体积：6080mL调节流速：0.5mL/min或8-12滴/m

18、in,3、加样,上样量：0.5mL缓冲液冲洗加样处2次,注意：加样的同时开始收集加样时且勿搅动树脂床面,4、洗脱与收集,尽量维持衡定柱压每2分钟收集一管，共收集25管,5、氨基酸的鉴定,每个收集管,1mL水合茚三酮,沸水浴15min,比色测定,绘制洗脱曲线,实验二 SDS-PAGE分离蛋白质,一、实验目的 掌握SDS-PAGE的工作原理和操作方法,二、原理不同蛋白质具有不同的分子量，并在一定的pH溶液中带有不同的电荷。但经过SDS处理后的蛋白质，分子表面完全被负电荷所覆盖，因此在电泳时，电泳迁移率近取决于蛋白质的分子量大小而与其所带电荷的性质无关。分子筛效应浓缩效应,SDS-PAGE分离蛋白质

19、,三、操作步骤,1.安装膜具,装封胶条，注意封胶条平面朝下，不能有裂口,盖上凹玻璃,将凹玻璃冲外装进槽里,将楔子插进，将底部插紧,2.配制凝胶溶液,胶的配制(平行电泳两块胶板)胶母液：8.4ml 配胶缓冲液：13ml 蒸馏水：4ml 10%TEMD：0.2ml，混匀 10%AP：0.2ml，混匀 3.灌胶，加到顶部，来回倾斜去气泡,插入梳子,胶凝后用夹子将玻璃夹出,用夹子夹紧玻璃将封胶条轻轻撕掉,旋转180度，凹玻璃向里,将玻璃放进槽内,加缓冲液,4.样品制备：将0.5ml 样品液，0.25ml 10%SDS和0.25ml 1%巯基乙醇于小试管中，置100水浴中煮沸3分钟后，取出冷却，然后，加

20、入0.25ml 上样缓冲液（0.05%溴酚兰+40%蔗糖溶液），混合。取出混合样品40微升加入样品槽，每个样品重复两个。,5.加 样,6.电泳,电泳：接通电源，电流恒定为80mA，待溴酚兰指示剂移至离下端0.5cm（约3小时），切断电源，拔去插头，倒出电极缓冲液于大烧杯中（如此缓冲液欲重用时，应把正负电极液分别贮存）。,7.剥 胶,8 染色：考马斯亮蓝染色，详见教材 9 脱色,凝胶（脱色之后）结果分析,1、计算迁移率（Rm值）：计算公式见教材。2、绘制标准曲线：以标准蛋白亚基的Rm值为横坐标，以相应分子量的对数值为纵坐标，即可绘制出测定蛋白质分子量的标准的线图。3、计算未知蛋白亚基样品的分子量

21、：根据未知样品样的Rm值，从上述标准曲线图中即可查出其分子量。,实验三 DNS法测定还原糖,一、实验目的 掌握还原糖定量测定的原理和方法,二、原理在碱性溶液中，还原糖变为烯二醇，烯二醇可被3，5二硝基水杨酸（DNS）氧化为糖酸，加热进一步产生一种红棕色的氨基化合物，在一定浓度范围内，棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比，以此测定糖的量。,三、操作步骤,1、葡萄糖标准曲线的绘制,详见教材,2、还原糖的制备,样品：苹果 滤液测定前稀释4倍 其余操作见教材,3、样品的酸水解和总糖的提取,滤液测定前稀释2倍 其余操作见教材,4、苹果样品中总糖和还原糖的测定,详见教材,实验四 多酚氧化酶的制备、性

22、质和影响因素,一、实验目的 学习从组织细胞中制备酶的方法 掌握多酚氧化酶的作用、化学性质及影响因素,二、原理多酚氧化酶催化儿茶酚氧化成儿茶醌，进一步聚合成褐色物质；通过反应液颜色的变化可大致判断反应的程度，进而推测酶的作用及活力的大小；酶是生物催化剂，易受到各种因素的影响，如温度、pH、底物浓度、酶浓度等。,三、操作步骤,1、酶的制备,150g土豆（3组）,150mL NaF溶液,匀浆,四层纱布过滤,每组取50mL,16g固体硫酸铵,430min,离心15min4000r/min,沉淀溶于15mL缓冲液中,粗酶液,2、多酚氧化酶的作用,三、操作步骤,37水浴反应，每间隔5min振荡，观察颜色变

23、化，共25min。,3、多酚氧化酶的化学性质,三、操作步骤,37水浴反应，10min。,4、底物专一性,三、操作步骤,37水浴反应，每间隔5min振荡，观察颜色变化，共25min。,5、底物浓度的影响,三、操作步骤,37水浴反应，1min。,6、酶浓度的影响,三、操作步骤,37水浴反应，2min。,7、H+浓度的影响,三、操作步骤,37水浴反应，5min。,实验五 碱性蛋白酶活力的测定（福林酚试剂法）,一、实验目的 学习测定蛋白酶活力的方法 掌握分光光度计的原理和使用方法,二、原理,酪蛋白,蛋白酶,酪氨酸,比色测定,钼蓝钨蓝,酪氨酸,福林酚,1、样品处理,三、操作步骤,详见教材,2、比色测定,

24、4支试管，分别加入1mL酶液40预热23min,空白管,平行管,1mL 2%酪蛋白40，10min,1mL 2%酪蛋白40，15min,2mL 三氯乙酸40，15min,2mL 三氯乙酸40，10min,过滤，分别取1mL滤液,（1）,（2）,（3）,三、操作步骤,2、比色测定,过滤，分别取1mL滤液,（3）,分别加入5mL Na2CO3溶液1mL福林酚试剂,（4）,40反应20min,（5）,（6）,比色测定A680，管做参比,三、操作步骤,3、绘制标准曲线,（1）按教材表322加各种试剂，福林酚试剂最后加入；（2）摇匀，40反应20min；（3）比色测定A680，管1做参比；（4）绘制标准

25、曲线，求K值。,4、酶活力的计算,实验六 菜花中核酸的分离与鉴定,一、实验目的 学习和掌握从植物组织中分离核酸的原理和方法 掌握定糖法测定核酸的原理及操作方法,二、原理核酸的提取：三氯乙酸或高氯酸除酸溶小分子 有机溶剂去脂类 浓盐溶液（10NaCl）提DNA 0.5M高氯酸提RNARNA核糖的测定:苔黑酚法DNA脱氧核糖的测定：二苯胺法,三、操作步骤,1、核酸的分离,菜花花冠20g,20mL95乙醇海砂,匀浆抽滤,滤渣,抽滤,提取物一,搅拌均匀抽滤,20mL丙酮,滤渣,20mL丙酮,搅拌5min抽滤,滤渣,20mL高氯酸,冰盐浴,搅拌抽滤,滤渣,20mL95乙醇,滤渣,20mL丙酮,搅拌5mi

26、n抽滤至干,滤渣,40mL10氯化钠,沸水浴15min,抽滤,滤渣,滤液,重复一次,20mL高氯酸,70水浴20min,抽滤,滤液,提取物二,三、操作步骤,2、RNA和DNA的定性鉴定,（1）二苯胺反应 按教材表315加入各种试剂，反应后观察并记录结果。（2）苔黑酚反应 按教材表316加入各种试剂，反应后观察并记录结果。,实验七 Bradford法测定蛋白质的含量,一、实验目的 学习考马斯亮蓝G250染色法测定蛋白质含量的原理和方法。,二、原理考马斯亮蓝G250与蛋白质结合后引起染料最大吸收光的改变，从465nm变为595nm；蛋白质染料复合物有较高的消光系数，蛋白最低检出量为1微克，灵敏度高；反应迅速，2min，且结合物在1h内稳定；干扰物质少。,三、操作步骤,1、牛血清白蛋白标准曲线的制作,按教材表312加入试剂；反应2min，以1号管为参比，测定A595；绘制标准曲线。,2、未知样品中蛋白质浓度的测定,详见教材,