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1、第三章 生物信息的传递（上）从DNA到RNA,3.1 RNA的转录3.2 启动子与转录起始3.3 原核生物与真核生物mRNA的特征比较3.4 终止与抗终止3.5 内含子的剪接、编辑及化学修饰,DNA序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存，并通过转录生成信使RNA、翻译生成蛋白质的过程来控制生命现象。,转录(transcription),基因表达,翻译(translation),拷贝出一条与DNA链序列完全相同(U替换T)的RNA单链的过程，是基因表达的核心步骤；,以新生的mRNA为模板，把核苷酸三联遗传密码子翻译成氨基酸序列、合成多肽链的过程，是基因表达的最终目的。,转 录,翻 译,A
2、TGC,RNA分子来自DNA。储存于DNA双链中的遗传信息通过转录酶促反应按照碱基互补配对的原则被转化成为单链RNA分子。生物体内共有3种,信使RNA(messenger RNA，mRNA),转移RNA(transfer RNA，tRNA),核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA),转录(transcription):是指以DNA为模板，在依赖于DNA的 RNA聚和酶催化下，以4中rNTP（ATP、CTP、GTP和UTP）为原料，合成RNA 的过程。,转录(transcription)生物体以DNA为模板合成RNA的过程,转录,在有些病毒中，RNA也可以指导合成RNA。,是基因表达
3、的第一步，也是最关键的一步。以Double Strand DNA中的一条单链作为转录模板(杂交实验所证实),T C G A G T A C,A G C T C A T G,C G A G U A C,G C A U,RNA聚合酶,有意义链,反意义链,RNA,PPi,5,5,3,GTP,UTP,CTP,ATP,UTP,RNA在DNA模板上的生物合成,3,3,5,转 录 过 程,有义链(sense strand)又称编码链 coding strand:指不作模板的DNA单链,反义链(antisense strand)又称模板链 template srand:指作为模板进行RNA转录的链,(60年代
4、以前的表示方法与此相反)没有 AU GC 的规律,在依赖DNA的RNA聚合酶作用下进行转录 AU、CG 合成RNA分子 转录合成RNA链的方向为53，模板单链DNA的极性 方向为35，而非模板单链的极性方向与RNA链相 同，均为53。（书写）基因转录方式为不对称转录(一条单链DNA 为模板,RNA 聚合酶的结合),参 与 转 录 的 物 质：,原料:4种NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶其他蛋白质因子,不对称转录 两层含义：（1）在DNA双链分子上，仅一股链可转录（2）模板链非永远在同一条单链上,模 板,为结构基因（有义链、编码连）,为反义链（模板链）,不对称
5、转录,3,3,5,5,（箭头表示转录产物生成方向）,3.1 RNA的转录,3.1.1 转录的基本过程 无论是原核还是真核细胞，转录的基本过程都包括:模板识别、转录起始、通过启动子及转录的延伸和终止。,RNA 的转录包括 promotion.elongation.terminaton 三过程 从启动子(promoter)到终止子(terminator)称为转录单 位(transcription unit)(转录起始点)原核生物的转录单位多为 polycistron in operon,真 核生物中的 转录单位多为monocistron,No operon 转录起点即转录原点记为1，其上游记为负值
6、，下游 记为正值,转录起始点,两个相关概念:操纵元(operon):是原核生物基因 表达调控的一个 完整单元，其中 包括结构基因、调节基因、操纵 子和启动子,酶与模板的辩认结合 1、转录起始点开始转录的位点，常标以+1 2、结合部位约为7个碱基长度，其中心位于上 游-10 bp处被称为 10区或 Pribnow 盒(TATA盒）。该 区具高度保守性，并易解链。3、识别部位RNA聚合酶亚基识别的部位，约 含6个碱基长度，其中心位于上游-35 bp处被称为 35 区。,启动序列(原核）,启动子（真核）顺式作用元件,TGTTGACA,TATAAT,35,53,DNA,编码链模板链,-35 区,-10
7、 区,+1,5 McGPPP,转录起始部位,启动子,基因转录区,RNA产物,NH2,翻译开始,转录开始,基本过程 1、转录起始 原核生物需要依赖 因子辨认转录起始点，被辨认的DNA区段处-35区特定序列。真核生物转录起始也需要RNApol对起始区上游DNA序列做辨认和结合，并生成起始复合物，但其上游DNA序列（统称为顺式作用元件）不象原核生物那样典型。,2、延长 在RNA聚合酶催化下，按 53 方向合成 5，3-磷酸二酯键。酶-DNA-RNA形成转录复合物。3、终止 原核生物有两种机制：（1）依赖 因子（Rho factor）的转录终止可识别来自RNA产物的终止信号，而不是来自DNA摸板。（2
8、）非依赖 因子的转录终止终止子特点是RNA产物具有发夹结构（茎-环结构）和一段富含polyU片段。真核生物的转录终止是与转录后修饰密切相关的：,启动子(promoter),指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域，它还包括一些调节蛋白因子的结合位点(频率、效率),模板识别阶段主要指RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。,转录起始前，启动子附近的DNA双键分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板DNA的碱基配对。转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生。,在原核生物中,通过启动子阶段,转录起始后直到形成9个核苷酸短链,此时RNA聚合酶一直处于启动子区，
9、新生的RNA链与DNA模板链的结合不够牢固，很容易从DNA链上掉下来并导致转录重新开始。一旦RNA聚合酶成功地合成9个以上核苷酸并离开启动子区，转录就进人正常的延伸阶段。,所以，通过启动子的时间代表一个启动子的强弱。一般说来，通过启动子的时间越短，该基因转录起始的频率也越高。,转录的延伸,RNA聚合酶离开启动子，沿DNA链移动并使新生RNA链不断伸长的过程,在37时，大肠杆菌RNA聚合酶完成该反应的速度为每秒40个核苷酸。,RNA链的延伸图解,转录的终止,当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物分离，转录泡瓦解，DNA恢复成双链状态，而RNA聚合
10、酶和RNA链都被从模板上释放出来,复 制 转 录模板 两股链 模板链（反义链）原料 dNTP NTP配对 A-T,G-C A-U,G-C 聚合酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶产物 半保留DNA 三种RNA,转录与复制的区别,真核生物RNA聚合酶不能直接识别基因的启动子区，需要转录调控因子(辅助蛋白质)按特定顺序结合于启动子上，RNA聚合酶才能与之相结合并形成复杂的前起始复合物。,转录和翻译的速度基本相等，37时，转录生成mRNA的速度每秒钟合成14个密码子，而蛋白质合成的速度大约是每秒钟15个氨基酸。,3.1.2 转录机器的主要成分,3.1.2.1 RNA聚合酶,原核和真核生物的RNA在分子组成
11、、种类和生化特性上各有特色。,不需要任何引物,RNA或RNA-DNA双链杂合体不能作为模板,一、原核生物的RNA polymerase(E.coli),1、全酶(Holo Enzyme)和核心酶(Core Enzyme),原核生物的RNA聚合酶(DDRP)E.coli的RNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（2）,起始因子,RNA聚合酶全酶及核心酶电泳图谱,(1)全酶（Holo Enzyme）用于转录的起始 依靠空间结构与DNA模板结合(与核心酶结合后 引起的构象变化)专一性地与DNA序列(启动子)结合 结合常数：1014mol 半衰期：数小时（107mol 1秒以下）转录效率低，速度缓慢（的结
12、合）,（2）核心酶（Core Enzyme）作用于转录的延伸过程（终止）依靠静电引力与DNA模板结合（蛋白质中碱性 基团与DNA的磷酸根之 间）非专一性的结合（与DNA的序列无关）结合常数：1011mol 半衰期：60秒,此外，新发现的一种亚基的功能尚不清楚。2、各亚基的特点和功能（1）因子 因子可重复使用 修饰RNApol构型 使Holo Enzyme 识别启动子的Sextama Box(35区),并通过与模板链结合,2,2,2,2,（3）全酶的组装过程,不同的因子识别不同的启动子 E.coli 中有四种因子（70、32、54、28）枯草杆菌中有11种因子（因子的更替对转录起始的调控）（2）
13、因子,核心酶的组建因子,促使RNApol 与DNA模板链结合,前端因子使模板DNA双链解链为单链 尾端因子使解链的单链DNA重新聚合为双链,（3）因子,完成NMP之间的磷酸酯键的连接 Editing 功能（排斥与模板链不互补的碱基）与Rho（）因子竞争RNA 3end,E site（elongation site RifR）:对NTP非专一性地结 合（催化作用和Editing功能）,（4）因子 参与RNA非模板链（sense strand）的结合（充当SSB）,构成Holoenzyme 后，因子含有两个位点 I site（initiation site.Rifs）:该位点专一性地结合 ATP或
14、者GTP（需要高浓度的ATP或GTP）,由于各亚基的功能，使全酶本身含有五个功能位点,有义DNA链结合位点（亚基提供）DNA/RNA杂交链结合位点（亚基提供）双链DNA解链位点（前端 亚基提供）单链DNA重旋位点（后端亚基提供）因子作用位点,E.coli RNA polymerase,用于起始和延伸,只用于起始,36.5 KD,36.5 KD,151 KD,155 KD,11 KD,70 KD,每个细胞中约有7000个RNA聚合酶分子,每一时刻有20005000个酶在执行转录DNA模板的功能,因子大大增加聚合酶对启动子的亲和力，并降低酶对非专一位点的亲和力，使酶专一性识别模板上的启动子,当新生
15、RNA链达到69个核苷酸时，能形成稳定的酶DNARNA三元复合物，并释放因子，转录进人延伸期,当聚合酶按5 3方向延伸RNA链时，解旋的DNA区域也随之移动。聚合酶可以横跨约40个碱基对，而解旋的DNA区域大约是17个碱基对。自由核苷酸能被聚合酶加到新生的RNA链上，并形成DNA-RNA杂合体。随着聚合酶在模板上的运动，靠近3端的DNA不断解旋，同时在5端重新形成DNA双链，将RNA链挤出DNA-RNA杂合体。RNA的3端大约有2030个核苷酸与DNA和聚合酶相结合。,RNA合成过程,起始,双链DNA局部解开,磷酸二酯键形成,终止阶段,解链区到达基因终点,延长阶段,RNA,启动子（promot
16、or),终止子(terminator),二、真核生物的RNApol 1、三种RNApol：根据对-鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类 RNApol 最不敏感（动、植、昆）RNApol 最敏感 RNApol 不同种类的敏感性不同 2、位置和转录产物 RNApol 核仁 活性所占比例最大 转录rRNA（5.8S、18S、28S）,RNApol 核质 主要负责 hnRNA、snRNA 的转录 hnRNA（mRNA 前体，核不均一RNA heterogeneous nuclear RNA）snRNA（核内小分子 RNA small nulear RNA)RNApol 核质 负责 tRNA、5S rRNA、Al
17、u序列和 部分 snRNA 目前在线粒体和叶绿体内发现少数 RNApol（活性较低）,真核生物线粒体和叶绿体中还存在着不同的RNA聚合酶。,线粒体RNA聚合酶只有一条多肽链，相对分子质量小于7x104，是已知最小的RNA聚合酶之一，与T7噬菌体RNA聚合酶有同源性,叶绿体RNA聚合酶比较大，结构上与细菌中的聚合酶相似，由多个亚基组成，部分亚基由叶绿体基因组编码,3、亚基组成：分子量500KDa,含两个大亚基和 712 个小亚基 RNApol：大亚基中有 C 末端结构域(carboxy terminal domain CTD)CTD中含一保守氨基酸序列的多个重复 TyrSerProThrSerP
18、roSer C 端重复七肽 不同生物中重复数目不一样（酶活性）,CTD中的 Ser和 Thr可被高度磷酸化 磷酸化的 RNApol 被称为A 非磷酸化的 RNApol 称为B CTD参与转录 B A 使 RNApol易于离开 启动子进入延伸过程（10倍）,真核生物中共有3类RNA聚合酶，它们在细胞核中的位置不同，负责转录的基因不同。真核生物RNA聚合酶一般有814个亚基所组成，相对分子质量超过5105。,聚合酶中有两个相对分子质量超过l105的大亚基；,同种生物3类聚合酶有共享小亚基的倾向，即有几个小亚基是其中3类或2类聚合酶所共有的,3类聚合酶的亚基种类和大小存在两条普遍遵循的原则,3.1.
19、2.2 转录复合物,启动子选择阶段,RNA聚合酶全酶对启动子的识别,聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭复合物（closed complex）,伴随着DNA构象上的重大变化，封闭复合物转变成开放复合物(open complex),开放复合物与最初的两个NTP相结合并在这两个核苷酸之间形成磷酸二酯键后(RNA聚合酶、DNA和新生RNA)三元复合物。,强启动子,封闭复合物 开放复合物（不可逆的快反应）,真核生物转录起始复合物的分子量很大：RNA聚合酶、7种辅助因子（包含多个亚基）。,三元复合物可以进入两条不同的反应途径,一是合成并释放29个核苷酸的短RNA转录物流产式起始;,二是尽快释放亚基，转录起始
20、复合物通过上游启动子区并生成由核心酶、DNA和新生RNA所组成的转录延伸复合物,转录的真实性取决于,有特异的转录起始位点,转录起始后按照碱基互补原则准确地转录,模板DNA序列及具有特异的终止部位,因子,只有带因子的全酶才能专一地与DNA上的启动子结合，选择其中一条链作为模板，合成均一的产物。因子的作用只是起始而已，一旦转录开始，它就脱离了起始复合物，而由核心酶负责RNA链的延伸。,因此，聚合酶全酶的作用是启动子的选择和转录的起始，而核心酶的作用是链的延伸。,终止信号,较稳定,3.2 启动子与转录起始,大肠杆菌RNA聚合酶与启动子的相互作用主要包括,3.2.1 启动子（promoter）的结构与
21、功能（）1、启动子由两个部分组成（1）上游部分 CAP-cAMP结合位点（基因表达调控的正控制位点）CAP（catabolite gene Activator Protein）降解物基因活化蛋白，环腺苷酸（cAMP）的受体蛋白（2）下游部分 RNApol的进入（结合）位点 35 10 包括识别位点和结合位点（R B位点）,2、RNA聚合酶的进入位点（1）Sextama 框（Sextama Box）-35序列，RNA聚合酶的松弛（初始）结合位点，RNA聚合酶依靠其亚基识别该位点 识别位点（R位点）大多数启动子中共有序列为 T82T84G78A65C54A45 重要性:很大程度上决定了启动子的强度
22、（RNApol 的因子）位置在不同启动子中略有变动,（2）Pribonow 框（Pribonow Box）-10序列，RNA聚合酶的牢固结合位点 结合位点（B 位点）一致序列：T80A95T45A60A50T96（TATPUAT）,位置范围 4 到13,因此又称TATA Box,启动子的研究：(RNA聚合酶保护法),保守序列（一致性序列）,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,（3）起始位点（initiation site）：1位点 RNA聚合酶的转录起始位点 起始NTP多为ATP或GTP(嘌呤),起始过程：a.全酶与启动子结合的封闭型启动子复合物的形成（R位点被因子发现并结合）,b、开放型启动
23、子复合物的形成 RNApol的一个适合位点到达10序列区域，诱导富 含A.T的Pribnow 框的“熔解”，形成1217bp的泡状 物，同时酶分子向10序列转移并与之牢固结合 开放型启动子复合物使RNApol聚合酶定向 两种复合物均为二元复合物（全酶和DNA）,1217bp,c.在开放型的启动子复合物中，RNApol的I位点和E位点的 核苷酸前体间形成第一个磷酸二酯键（亚基）三元复合物形成+1位多为CAT模式,位于离开保守T 69 个核苷酸处,（4）因子解离 核心酶与DNA的亲和力下降 起始过程结束核心酶移动进入延伸过程,转录的起始过程,核心酶,1217bp,CAP-cAMP 结合位点（也称C
24、AP位点）转录调控中，I 阻遏蛋白 负调控 lac 操纵子模型,I,许多基因的表达还存在正调控机制 例如:E.coli 培养基中乳糖和葡萄糖共存时 只有葡萄糖被 利用 原因：CAP位点的正调控 葡萄糖缺少时，腺苷酸环化酶将ATP cAMP，cAMP与CAP位点结合,此时启动子的进入位点才能 与RNApol结合 葡萄糖存在时，cAMP不能形成，没有CAPcAMP 与CAP位点结合，启动子的RNApol进入位点不能结 合RNApol,因此,一个操纵元中有两道控制开关,只有同时打开,结构基因才 能进行转录。（对 lac操纵元而言，只有没有葡萄糖，有乳糖时才能进行录）（1）CAP位点的组成（70 40
25、）位点：70 50 包括一个IR 序列 强结合位点 位点：50 40 弱结合位点 位点对位点具有协同效应（cooperativity）,（2）位点结合CAPcAMP复合物后，促使RNApol进入 Sextama Box,最终与10序列结合起始转录 原因：CAPcAMP复合物与位点结合 Sextama Box 富含G.C区域（G.C岛区）稳定性降低 Pribnow Box 的溶解温度降低 促进开放型启 动子复合物的形成 促进转录,4、RNApol 在DNA上结合位点的鉴定 DNase 法-40bp 而足迹法（footprinting）结果相对准确 足迹法原理：限制酶切割结合有RNApol的DNA
26、 大分子DNA 末端标记该DNA（Klenow片段标记3,碱性磷酸酯 酶标记5）用内切酶降解DNA（控制反应条件）凝胶电泳分离，放射自显影观察,大片段DNA,末端标记大分子DNA,重新结合RNApol,作对照直接用DNase 进行降解,电泳,用微量DNase降解,电泳,用足迹法鉴定出来的 RNApol 与DNA的结合区域为+20 50（40），大约 60 70 bp 实验中还发现.,实验中还发现DNA的两条链受 RNApol 的保护程度不同，说明RNApol与两条链的结合是不对称的，表明转录只需要一条模板，即单链转录,RNA聚合酶保护法,开始转录,T T G A C AA A C T G T,
27、-35 区,T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,原核生物启动子保守序列,原核生物启动子35区：一致性序列为TTGACA是RNA-pol的辨认位点10区：一致性序列为TATAAT又叫Pribnow盒是RNA-pol的结合位点,真核生物启动子,5、启动子各位点与转录效率的关系（1）35 序列与10 序列与转录效率的关系 标准启动子 35 TTGACA 10 TATAAT,不同的启动子 a.与标准启动子序列同源性越高 启动强度越大,b.与标准启动子同源性越低 启动强度越小 c.与标准启动子差异很大时 由另一种因子启动,原因:,35序列通过被 因子识别的容易 决定启
28、动子强度 10序列影响开放型启动子复合物形成的速度 决定启动子强度,启动子上升突变、启动子下降突变,（2）35序列与10序列的间隔区与转录效率的关系 碱基序列并不重要 间距非常重要，17bp的间距转录效率最高 间距上的突变种类：间距趋向于17bp 上升突变 间距远离17bp 下降突变,E.Coli各识别的启动子的序列,由含70RNA多聚酶全酶识别的典型大肠杆菌启动子,3.2.2 启动子区的识别,在启动子区DNA双螺旋结构中，腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶上的某些基团是氢键供体，而4种碱基中的某些基团是氢键受体。由于它们分别处于DNA双螺旋的大沟或小沟内，因此都具有特定的方位，而酶分子中也有处于特定空间
29、构象的氢键受体与供体，当它们与启动子中对应的分子在一定距离内互补时，就形成氢键，相互结合。,RNA聚合酶不直接识别碱基对本身，是通过氢键互补的方式识别启动子的,3.2.3 酶与启动子区的结合,在RNA聚合酶与启动子相互作用的过程中，聚合酶首先与启动子区闭合双链DNA相结合，形成二元闭合复合物，然后经过解链得到二元开链复合物。解链区一般在-9+13之间，而酶与启动子结合的主要区域在其上游。,一旦开链区解链，酶分子能以正确的取向与解链后的有关单链相互作用，形成开链复合物。因此，RNA聚合酶既是双链DNA结合蛋白，又是单链DNA结合蛋白。DNA开链是按照DNA模板序列正确引入核苷酸底物的必要条件。,
30、3.2.4-10区和-35区的最佳间距,在原核生物中，-35区与-10区之间的距离大约是1619bp,保持启动子这二段序列以及它们之间的距离都是重要的，否则就会改变它所控制基因的表达水平。,小于 15 bp 或大于 20 bp 都会降低启动子的活性,因为增减bp，-35区相对于-10区旋转（增减一个bp会使两者之间的夹角发生36的变化）所产生的超螺旋会发生改变。若要使酶与DNA在这个区域内保持正确的取向，就必须使二者之一发生扭曲，需要增加结合自由能。,如果把Pribnow区从TATAAT变成AATAAT就会大大降低其结构基因的转录水平;,增加Pribnow区共同序列的同一性。例如，在乳糖操纵子
31、的启动子中，将其Pribnow区从TATGTT变成TATATT，就会提高启动子的效率，提高乳糖操纵子基因的转录水平。,3.2.5 增强子及其功能,增强子的发现从SV40开始，在SV40的转录单元上发现它的转录起始位点上游约200bp处有两段72bp长的重复序列，它们不是启动子的一部分，但能增强或促进转录的起始，除去这两段序列会.若保留其中一段或将之取出插至DNA分子的任何部位，就能,这种能强化转录起始的序列为增强子或强化子(enhancer)。后来在许多基因的启动区中陆续发现了增强子的存在。,把-珠蛋白基因置于带有上述72bp序列的DNA分子上，发现它在体内的转录水平提高了200倍。而且，无论
32、把这段72bp序列放在转录起点上游1400bp或下游3300bp处，它都有转录增强作用。增强子通过影响染色质DNA-蛋白质结构并改变超螺旋而改变模板的整体结构，使得RNA聚合酶更容易与模板DNA相结合，起动基因转录。,3.2.6 真核生物启动子对转录的影响,启动子是确保转录精确而有效地起始的DNA序列。1979年，美国科学家Goldberg首先注意到真核生物中，由RNA聚合酶II催化转录的DNA序列5上游区有一段与原核生物Pribnow区相似的富含TA的保守序列。由于该序列前4个碱基为TATA，所以又称为TATA区(TATA box)。,此后10多年间，科学家通过对许多基因启动子区的分析，发现
33、绝大多数功能蛋白基因的启动子都具有共同的结构模式。简单地说，真核基因的启动子在-25-35区含有TATA序列，在-70-80区含有CCAAT序列(CAAT box)，在-80-110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列(GC box)。TATA区上游的保守序列称为上游启动子元件(upstream promoter element，UPE)或称上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)。,原核和真核基因转录起始位点上游区的结构存在很大的差别。,原核基因启动区范围较小，TATAAT(Pribnow区)的中心位于-10，上游只有TTGACA区(-35区)作
34、为RNA聚合酶的主要结合位点，参与转录调控;真核基因的调控区较大，TATA A/TA区位于-20-30，而-40-110区为上游激活区。,真核基因除了含有可与原核基因启动子相对应的CAAT区（7078区）之外，大多数基因还拥有GC区和增强子区。,TATA区和其他两个UPE区的作用有所不同。,主要作用是使转录精确地起始，如果除去TATA区或进行碱基突变，转录产物下降的相对值不如CAAT区或GC区突变后明显，但发现所获得的RNA产物起始点不固定,CAAT区或GC区是决定转录产物产率高低的,CAAT区和GC区主要控制转录起始频率，基本不参与起始位点的确定。CAAT区对转录起始频率的影响最大，该区任一
35、碱基的改变都将极大地影响靶基因的转录强度，而启动区其他序列中一两个碱基的置换则没有太大的影响。在TATA区和相邻的UPE区之间插入核苷酸也会使转录减弱。,尽管这3种启动子区序列都有着重要功能，但并不是每个基因的启动子区都包含这3种序列。有些基因，如SV40的早期基因，缺少TATA和CAAT区，只有6个串联在上游-40-110位点的GC区;有些基因，如组蛋白H2B，不含GC区，但有两个CAAT区，一个TATA区。,真核细胞中存在着大量特异性或组成型表达的、能够与不同基因启动子区UPE相结合的转录调控因子。基因转录实际上是RNA聚合酶、转录调控因子和启动子区各种调控元件相互作用的结果。,一、真核生
36、物的RNApol 1、三种RNApol：根据对-鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类 RNApol 最不敏感（动、植、昆）RNApol 最敏感 RNApol 不同种类的敏感性不同 2、位置和转录产物 RNApol 核仁 活性所占比例最大 转录rRNA（5.8S、18S、28S）,RNApol 核质 主要负责 hnRNA、snRNA 的转录 hnRNA（mRNA 前体，核不均一RNA heterogeneous nuclear RNA）snRNA（核内小分子 RNA small nulear RNA)RNApol 核质 负责 tRNA、5S rRNA、Alu序列和 部分 snRNA 目前在线粒体和叶绿体内
37、发现少数 RNApol（活性较低）,3、亚基组成：分子量500KDa,含两个大亚基和 712 个小亚基 RNApol：大亚基中有 C 末端结构域(carboxy terminal domain CTD)CTD中含一保守氨基酸序列的多个重复 TyrSerProThrSerProSer C 端重复七肽 不同生物中重复数目不一样（酶活性）,CTD中的 Ser和 Thr可被高度磷酸化 磷酸化的 RNApol 被称为A 非磷酸化的 RNApol 称为B CTD参与转录 B A 使 RNApol易于离开 启动子进入延伸过程（10倍）二、真核生物的启动子 三种 RNApol 三种转录方式 三种启动子 三类基
38、因，类 类 类,1、RNApol的启动子 结构最复杂 位于转录起始点的上游,有多个短序列元件组成 通用型启动子（无组织特异性）（1）帽子位点（cap site）：转录起始位点 与Prok.的“CAT模式”相似（2）TATA框（Hogness 框或 Goldberg-Hogness 框）位于30处 一致序列为T82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37）,定位转录起始点的功能（类似原核的Pribnow框）TATA是绝大多数真核基因的正确表达所必需的（3）CAAT框（CAAT box）位于75bp处,一致序列为GGC/TCAATCT 前两个 G 的作用十分重要(转录效率)增强启动子
39、的效率、频率，不影响启动子的特异性（距转录起始点的距离，正反方向）以上三个保守序列在绝大多数启动子中都存在,（4）增强子（enhancer）（又称远上游序列 far upstream sequence）在100以上 SV40的两个正向重复研究得最清楚（DR）-107178、179 250 各 72bp 该增强子的特点如下：对依赖于TATA框的转录的增强效应高于不依赖 的情况,距离效应:离72bp越近的容易起始转录 转录方向离开72bp的起始序列优先转录 细胞类型的选择：不同类型中作用有差异 表明其作用具有细胞或组织特异性（调节蛋白）（5）GC框（GC box）位于90附近，较常见的成分 核心序
40、列为GGGCGG 可有多个拷贝，也可以正反两方向排列,（6）其他元件 八聚核苷酸元件（octamer element OCT元件）一致序列为 ATTTGCAT KB元件 一致序列为 GGGACTTTCC ATF元件 一致序列为 GTGACGT 还有一些位于起始点下游的相关元件（7）不同元件的组合情况 不同元件的数目、位置、和排列方向均有差异 例如：SV40的早期启动子中有6个GC框,小结：不同启动子中每种元件与转录起始点的距离不同 不同启动子中的相应元件互相交换,形成的杂交 启动子功能没有变化 各种元件将相应的蛋白因子结合到启动子上，组成起始复合物，蛋白因子间的相互作用决定 了转录的起始,2、
41、RNApol 启动子结构（1）分为三类，每种识别方式不同 a、下游启动子（内部启动子）位于转录起始点的下游 5SRNA 和 tRNA基因 可分为两类 b、上游启动子 snRNA,（2）内部启动子的发现 最早发现于非洲爪蟾的5S rRNA基因 试验设置：非洲爪蟾的卵母细胞提取液作为体外转录体系，进行缺失试验 以不同长度的5S rRNA基因为模板进行转录 结果：缺失55以前和缺失80以后的序列都能正常转录 缺失55到80序列不能转录,结论：5S rRNA基因的启动子位于基因内部 该启动子可使RNApol在其上游的55bp处起始转录（3）内部启动子分为两类 均含两个短序列元件，中间由其他序列隔开 第
42、一类：含A框和C框（5S rRNA基因）第二类：含A框和B框（tRNA基因、VARNA基因）间隔序列长短差异很大 其中内部启动子起被 RNApol 识别的作用,三、真核生物的转录过程,（一）转录起始,真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,顺式作用元件(cis-acting element),1.转录起始前的上游区段,AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚体,2.转录因子,能直接或间接辨认和结
43、合转录上游区段DNA的蛋白质，统称为反式作用因子(trans-acting factors)。,反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(trans-criptional factors,TF)。,参与RNA-pol 转录的TF,3.转录起始前复合物(pre-initiation complex,PIC),真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。,4.拼板理论(piecing theory),一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性和专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。,（二
44、）转录延长,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,RNA-pol前移处处都遇上核小体。,转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小体,转录延长中的核小体移位,转录方向,和转录后修饰密切相关,5-AAUAAA-,5-AAUAAA-,Poly(A),mRNA,（三）转录终止,3.3 原核生物与真核生物 mRNA的特征比较,mRNA在大肠杆菌细胞内占总RNA的2%左右(tRNA占16%，而rRNA则占80%以上)。,直到20世纪70年代初才首次将这一重要物质从细胞中分离出来。,现已清楚，许多基因的
45、mRNA在体内还是相当稳定的，半衰期从几个小时到几天不等。目前，人们己能从几乎所有生物体内分离纯化编码任何蛋白质的mRNA。,mRNA在所有细胞内执行着相同的功能，即通过密码三联子翻译生成蛋白质，但其生物合成的具体过程和成熟mRNA的结构在原核和真核细胞内是不同的。真核细胞mRNA最大特点在于它往往以一个较大相对分子质量的前体RNA出现在核内，只有成熟的、相对分子质量明显变小并经化学修饰的mRNA才能进入细胞质参与蛋白质的合成。,真核细胞mRNA的合成和功能表达发生在不同的空间和时间范畴内,原核生物中，mRNA的转录和翻译不仅发生在同一个细胞空间里，而且这两个过程几乎是同步进行的，蛋白质合成往
46、往在mRNA刚开始转录时就被引发,一个原核细胞的mRNA(包括病毒)有时可以编码几个多肽，而一个真核细胞的mRNA最多只能编码一个多肽,原核生物常以AUG作为起始密码子，有时GUG或UUG也作为起始密码子；真核生物几乎永远以AUG作为起始密码子,3.3.1 原核生物mRNA的特征,细菌基因的转录与翻译是紧密相联的，基因转录一旦开始，核糖体就结合到新生mRNA链的5端，启动蛋白质合成，而此时该mRNA的3端还远远没有转录完全。在电子显微镜下，我们可以看到一连串核糖体紧紧跟在RNA聚合酶后面。,1.原核生物mRNA的半衰期短,绝大多数细菌mRNA的半衰期很短，mRNA的降解紧随着蛋白质翻译过程发生
47、。转录开始1 min后，降解就开始了，当一个mRNA的5端开始降解时，其3端部分仍在合成或被翻译。mRNA降解的速度大概是转录或翻译速度的一半。,因为基因转录和多链肽延伸的速度基本相同，所以细胞内某一基因产物(蛋白质)的多少决定于转录和翻译的起始效率，以大肠杆菌色氨酸合成酶基因为例，平均每分钟约有15次转录起始，这些mRNA链从生成到降解平均被翻译10次，所以，稳定状态下细胞中每分钟生成150个多肽。我们所讨论的mRNA的半衰期只是统计学上的平均值。,细菌mRNA可以同时编码不同的蛋白质。编码多个蛋白质的mRNA为多顺反子mRNA。多顺反子mRNA是一组相邻基因的转录产物。这一组基因被称为一个
48、操纵子。单顺反子mRNA为只编码一个蛋白质的mRNA。,2、许多原核生物mRNA以多顺反子的形式存在,所有mRNA都被分成3部分:编码区、位于AUG之前的5端上游非编码区以及位于终止密码子之后不翻译的3端下游非编码区。编码区始于起始密码子AUG，经一连串编码氨基酸的密码子直至终止密码子。对于多顺反子mRNA中的第一个顺反子来说，一旦mRNA的5端被合成，翻译起始位点即可与核糖体相结合，而后面几个顺反子翻译的起始就会受其上游顺反子结构的调控。,情况一,第一个蛋白质合成终止以后，核糖体分解成大、小亚基，脱离mRNA模板，第二个蛋白的翻译必须等到新的小亚基和大亚基与该蛋白起始密码子相结合后才可能开始
49、,情况二,前一个多肽翻译完成以后，核糖体大、小亚基分离，小亚基不离开mRNA模板，而是迅速与游离的大亚基结合，启动第二个多肽的合成,在噬菌体RNA中，一个顺反子的翻译有时完全取决于它前面顺反子的翻译，因为噬菌体RNA往往形成复杂的二级结构，只有第一个翻译起始位点是暴露的，在这个顺反子翻译产生多肽的过程中，核糖体的运动破坏了后续顺反子的二级结构，才使起始位点较容易与核糖体相结合形成起复合物,3、原核生物mRNA的5无帽子结构，3端无或者只有较短的poly(A)结构,AUG上游712个核苷酸处有一段被称为SD序列的保守区,原核细胞mRNA的结构特点,5,3,先导区,AGGAGGU,SD区,一条mR
50、NA链编码几种功能相关的蛋白质,位于mRNA编码区上游的一个短片段，由10个碱基组成（5AAACAGGAGG3），称为SD顺序，与30S小亚基中的16S rRNA3端的六碱基顺序（3UCCUCC5）顺序互补，这意味着核糖体能选择正确的AUG密码来起始蛋白质的合成。,S-D序列,3.3.2 真核生物mRNA的特征,凡是编码功能蛋白的真核基因都通过RNA聚合酶进行转录。,真核基因几乎都是单顺反子，只包含一个蛋白质的信息，其长度在几百到几千个核苷酸之间。,一个完整的基因，不但包括编码区(coding region)，还包括不编码氨基酸的5和3端的特异性序列。,基因的分子生物学定义是,产生一条多肽链的
