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1、第五章 核酸5.1 概述核酸(nucleic acid)以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。DNA(Deoxyribonucleic acid)脱氧核糖核酸 RNA(Ribonucleic acid)核糖核酸,1.核酸的发现和研究工作进展1868年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取“核素”1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构1968年 Nirenberg发现遗传密码1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶1981年 Gilbert和Sanger建立DNA 测序方法1985年 M
2、ullis发明PCR 技术1990年 美国启动人类基因组计划(HGP)1994年 中国人类基因组计划启动2001年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架,脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA),核糖核酸(ribonucleic acid,RNA),90%以上分布于细胞核，其余分布于核外，如：线粒体，叶绿体，质粒等。携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。,分布于胞核、胞液。参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。,2.核酸的分类及分布、功能,5.2 核酸的分子组成5.2.1 元素组成 主要元素组成：C、H、O、N、P(
3、911%)与蛋白质比较，核酸一般不含S，而P的含量较为稳定，占911%。,5.2.2 核酸的组成,1.核酸基本构成单位：核苷酸(nucleotide),核苷酸由戊糖、磷酸和含氮碱三部分构成,戊糖,-D-核糖(ribose),-D-2-脱氧核糖(deoxyribose),碱基,胺式亚胺式互变异构,酮式烯醇式互变异构,碱基的结构特征,嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含有共轭双键体系，在紫外区有吸收（260 nm左右）。,核苷(nucleoside)碱基和核糖（或脱氧核糖）通过糖苷键连接形成核苷（或脱氧核苷）。,核糖核苷：AR,GR,UR,CR脱氧核糖核苷：dAR,dGR,dTR,dCR,糖与碱基之间的C-N
4、键，称为C-N糖苷键。,核苷酸(ribonucleotide)核苷（脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。,核苷酸：AMP、GMP、UMP、CMP脱氧核苷酸：dAMP、dGMP、dTMP、dCMP,常见核苷酸的结构与命名,2.核苷酸的其他形式 稀有核苷酸：稀有碱基/核苷/核苷酸 游离核苷酸及其衍生物：多磷酸核苷：NDP、NTP。环化核苷酸：cAMP、cGMP等。辅酶或辅基：NAD、NADP、FAD、CoA等，均含有AMP。活性代谢物：尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)、胞嘧啶核苷二磷酸胆碱（CDP-胆碱），等。,稀有核苷酸（修饰成分）核酸中也存在一些不常见的稀有碱基（修饰碱基）。稀
5、有碱基的种类很多，但含量很少，大部分是上述碱基的甲基化产物。,5-7-甲基鸟嘌呤核糖核酸,核苷酸的衍生物ATP,ATP的性质,ATP分子的最显著特点是含有两个高能磷酸键。ATP水解时,可以释放出大量自由能。ATP是生物体内最重要的能量转换中间体。ATP 水解释放出来的能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。ATP也是一种很好的磷酰化剂。磷酰化反应的底物可以是普通的有机分子，也可以是酶。磷酰化的底物分子具有较高的能量（活化分子），是许多生物化学反应的激活步骤。,cAMP和cGMPcAMP(3,5-环化腺苷酸)和cGMP(3,5-环化鸟苷酸)的主要功能是作为细胞的第二信使。cAMP和cGMP的环状
6、磷酯键是一个高能键。在pH7.4，cAMP和cGMP的水解能约为43.9KJ/mol，比ATP水解能高得多。,辅酶类核苷酸,多聚核苷酸,5.3 核酸的结构5.3.1 一级结构（primary structure）一级结构是指核酸分子中核苷酸的排列顺序及连接方式。核苷酸的排列顺序代表了遗传信息。1.核苷酸的连接方式：3，5磷酸二酯键2.核酸的基本结构形式：多核苷酸链 信息量：4n 末端：5端、3端 多核苷酸链的方向：5端3端(由左至右),RNA一级结构,DNA一级结构,3.表示方法：结构式、线条式、文字缩写,5ACTGCATAGCTCGA 3,DNA双螺旋结构的研究背景 碱基组成分析Charga
7、ff 规则：A=T；GC 碱基的理化数据分析：A-T、G-C以氢键配对较合理 DNA纤维的X-线衍射图谱分析,5.3.2 DNA的空间结构1.DNA的二级结构（secondary structure）碱基组成规则Chargaff规则：A=T，GC；A+GT+C（嘌呤与嘧啶的总数相等）有种属特异性无组织、器官特异性不受年龄、营养、性别及其他环境等影响,DNA双螺旋结构(double helix model)的特点,DNA分子由两条DNA单链组成。DNA的双螺旋结构是分子中两条DNA单链之间基团相互识别和作用的结果。双螺旋结构是DNA二级结构的最基本形式。,DNA双螺旋(B-DNA)结构的要点DN
8、A分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链（简称DNA单链）组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为5端3端，而另一条链的方向为3端5端。,嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成90角。,螺旋横截面的直径约为2nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈的高度）为3.4nm。,维持两条DNA链相互结合的力是链间碱基对形成的氢键。碱基结合具有严格的配对规律：A与T结合，G与C结合，这种配对关系，称为碱基互补。A和T之间形
9、成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。,螺旋表面形成大沟（major groove）及小沟（minor groove），彼此相间排列。小沟较浅；大沟较深，是蛋白质识别DNA碱基序列的基础。氢键维持双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性。,其他螺旋形式Z-DNA（左手双螺旋）A-DNA、B-DNA、C-DNA、D-DNA,A B Z,外型 粗短 适中 细长,螺旋方向 右手 右手 左手,螺旋直径 2.55nm 2.37nm 1.84nm,碱基直升 0.23nm 0.34nm 0.38nm,碱基夹角 32.70 34.60 60.00,每圈碱基
10、数 11 10.4 12,轴心与碱基对关系,2.46nm 3.32nm 4.56nm,碱基倾角 190 10 90,糖苷键构象 反式 反式 C、T反式，G顺式,大沟 很窄很深 很宽较深 平坦,小沟 很宽、浅 窄、深 较窄很深,A型DNA,B型DNA,Z型DNA,DNA双螺旋的稳定性 DNA双螺旋结构在生理条件下很稳定。维持这种稳定性的因素包括：两条DNA链之间形成的氢键、碱基堆积力。双螺旋结构内部形成的疏水区，消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响；介质中的阳离子（如Na+、K+和Mg2+）或组蛋白中和了磷酸基团的负电荷，降低了DNA链之间的排斥力等。改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳定
11、性。,天然存在的DNA分子最显著的特点是很长，分子质量很大，一般在1061010。大肠杆菌染色体由400万碱基对（basepair，bp）组成的双螺旋DNA单分子。其长度为1.4106nm，相当于1.4mm，而直径为20nm，相当原子的大小。黑腹果蝇最大染色体由6.2107bp组成，长2.1cm。多瘤病毒的DNA由5100bp组成，长1.7mm。,DNA的三螺旋结构,DNA三链间的碱基配对,2.DNA的三级结构 双螺旋进一步扭曲,形成一种比双螺旋更高层次的空间构象。包括：线状DNA形成的纽结、超螺旋和多重螺旋、环状DNA形成的结、超螺旋和连环体等。,超螺旋结构（superhelix或super
12、coil）DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构正超螺旋（positive supercoil）盘绕方向与DNA双螺旋方同相同负超螺旋（negative supercoil）盘绕方向与DNA双螺旋方向相反,原核生物：共价封闭的环状双螺旋分子超螺旋结构：双螺旋基础上的螺旋化正超螺旋(positive supercoil)：盘绕方向与双螺旋方同相同负超螺旋(negative supercoil)：盘绕方向与双螺旋方向相反,DNA在真核生物细胞核内的组装 核小体（nucleosome）：由DNA和组蛋白构成。组蛋白核心：H2B,H2A,H3,H4 DNA：以负超螺旋缠绕在组蛋白上 H1组蛋白在核小体之
13、间,DNA的存在形式,DNA双螺旋片段,串珠状核小体,染色质纤维,伸展形染色质片段,密集形染色质片段,整个染色体,DNA的功能 DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。基因从结构上定义，是指DNA分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。,5.3.3 RNA的分子结构RNA的种类、分布和功能,RNA的结构特点 RNA是单链分子，因此在RNA分子中，嘌呤的总数不一定等于嘧啶的总数。RNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结构，不能形成双螺旋的部分，则形成单链突环。这种结构称为“发夹型”结构。在RNA的双
14、螺旋结构中，碱基的配对情况不象DNA中严格。G除了可以和C配对外，也可以和U配对。G-U配对形成的氢键较弱。不同类型的RNA,其二级结构有明显的差异。tRNA中除了常见的碱基外，还存在一些稀有碱基，这类碱基大部分位于突环部分。,信使RNA的结构与功能真核生物mRNA的结构特点大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。大多数真核mRNA的3末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾。,真核生物mRNA成熟过程,内含子(intron),外显子(exon),帽子结构和多聚A尾的功能,mRNA从核内向胞质的转
15、位mRNA的稳定性维系翻译起始的调控,mRNA的功能 把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。,tRNA的结构与功能tRNA的一级结构特点分子较小，含较多的稀有碱基(1020%)和非标准碱基配对3末端为-CCA-OH5末端大多数为G具有TC,稀有碱基，如：次黄嘌呤(I)、双氢尿嘧啶(DHU)、假尿嘧啶()、7甲基鸟嘌呤(mG),tRNA的二级结构三叶草形(cloverleaf pattern)氨基酸臂DHU环：识别氨酰-tRNA合成酶反密码环额外环TC环：识别核蛋白体（核糖体）,氨基酸臂,额外环,tRNA的三级结构倒L形,tRNA
16、的功能：活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,rRNA的结构与功能 结构特征：单链，螺旋化程度较tRNA低 与蛋白质组成核糖体后方能发挥其功能 rRNA的功能：组成核蛋白体，作为蛋白质合成的场所。,核糖体的组成,其他小分子RNA及RNA组学 除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA（small non-messenger RNAs,snmRNAs），或非编码蛋白质的RNA（non-coding RNA，ncRNA）。ncRNA在在基因表达以及应激信号传导等方面起着重要的调节作用。因此，有人也将其称为调节RNA（regulatory
17、RNA）。,snmRNAs的种类 核内小RNA(snRNA)核仁小RNA(snoRNA)胞质小RNA(scRNA)催化性小RNA 小片段干涉RNA(siRNA)snmRNAs的功能 参与hnRNA和rRNA的转录后加工和转运以及基因表达过程的调控等。,小片段干扰RNA（siRNA），又称“引导RNAs”（guide RNAs）：一些小的双链RNA可以高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNA interference，RNAi，也译作RNA干预或干涉）。它是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。,RNAi的作用机制：包括起始阶段和
18、效应阶段。在起始步骤，生物宿主将外源基因表达的双链RNA进行切割，产生具有特定长度（19-21nt）和序列的小片段RNA；在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将siRNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3端12个碱基的位置切割mRNA。,RNA组学:RNA组学研究细胞中snmRNAs的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时间、不同状态下snmRNAs的表达具有时间和空间特异性。,5.4 核酸的理化性质1.酸性化合物两性解离，
19、但酸性强 电泳行为泳向正极（pH7-8）2.高分子性质 沉淀行为加盐（中和电荷）；乙醇 粘度：DNARNA 超离心沉降 凝胶过滤 分子大小单位：分子量（道尔顿，D）、碱基对数目（bp）、离心沉降常数（S）,紫外吸收,OD260的应用 DNA或RNA的定量 OD2601.0相当于 50g/mL双链DNA 40g/mL单链DNA（或RNA）20g/mL寡核苷酸判断核酸样品的纯度 DNA纯品：OD260/OD2801.8 RNA纯品：OD260/OD2802.0,4.紫外吸收最大吸收波长：260nm 核酸定量分析 核酸定性分析5.变性、复性、分子杂交DNA变性（DNA denaturation）：D
20、NA变性是指在理化因素作用下，DNA分子中的氢键断裂，碱基堆积力遭到破坏，双螺旋结构解体，双链分开形成单链的过程。,DNA的变性(denaturation),方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。,变性后其它理化性质变化：OD260增高；粘度下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸碱滴定曲线改变；生物活性改变,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,DNA变性,增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。,当DNA的稀盐溶液加热到80-100时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。,融解温度（melting temperature,Tm）：DN
21、A热变性过程中，紫外吸收达到最大值的一半时溶液的温度称为融解温度（Tm）或解链温度、变性温度。,实验室常用的方法热变性,影响Tm值的因素,(1)溶液的性质,(2)DNA的性质和组成,大肠杆菌DNA在不同浓度KCl溶液下的熔融温度曲线,GC含量越高，Tm越大,（1）变性后理化性质改变DNA溶液的粘度降低浮力密度增加旋光偏振光改变紫外吸收增加（高色效应）高色效应（hyperochromic effect）：DNA变性后，在260nm处的紫外吸收增高，称为高色效应或增色效应。,（2）变性后的DNA一级结构没有改变。,（3）融解温度（melting temperature,Tm）：DNA热变性过程中，
22、紫外吸收达到最大值的一半时溶液的温度称为融解温度（Tm）,GC含量越高，Tm越大DNA越长，Tm越大溶液离子强度增高，Tm值增加DNA越纯，相变范围越小,2、DNA复性,DNA复性(renaturation)的定义:在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。,减色效应（hypochromic effect）:DNA复性时，其溶液OD260降低。,DNA复性,在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配
23、对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。,核酸分子杂交(hybridization),核酸的杂交,DNA-DNA杂交双链分子,不同来源的DNA分子,核酸分子杂交的应用:研究基因的位置确定两种核酸序列的相似性检测样品中的特异序列基因芯片技术的基础,核酸探针（nucleic acid probe）:能特异性的探测带某一特定序列的DNA或RNA分子的标记核酸分子。,3、核酸分子杂交(hybridizatio
24、n),由不同来源的核酸单链形成杂化双链的过程,分子杂交技术的应用：基因克隆筛选、酶切图谱制作、特定基因序列的定量和定性、突变分析、疾病诊断等,第五节 核酸酶(nucleases),核酸酶是指所有可以水解核酸的酶,一、种类,1、根据底物分类DNase、RNase；单链核酸酶、双链核酸酶、杂合双链核酸酶,2、根据催化部位分类：外切核酸酶和内切核酸酶外切酶：5端3端或3端5端核酸外切酶。内切酶：限制性核酸内切酶和非限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶(restriction endonucleases)：能够识别DNA分子的特定核苷酸序列，并在识别位点或其周围断开DNA双链的一类核酸酶,参与DNA的合
25、成与修复及RNA合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程 负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸 在消化液中降解食物中的核酸以利吸收 体外重组DNA技术中的重要工具酶,生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解,二、核酸酶的功能,三、核 酶,催化性DNA(DNAzyme)人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。,催化性RNA(ribozyme)作为序列特异性的核酸内切酶降解mRNA。,第六节核酸的核苷酸序列测定,一、化学裂解法：标、切、分、染、读,二、酶解法(测RNA)：标、切、分、染、读,三、合成终止法：标、合、分、染、读,Sanger测定DNA核苷酸序列的方法：DNA合成终止法（双脱氧DNA链合成终止法）。,
