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1、生物技术与分离提取,第七章,常用的分离提取技术方法：,1、破碎法分离提取技术2、离心分离提取技术3、超声波萃取分离法4、微波萃取分离法5、气浮分离法6、色谱法（包括纸色谱、薄层色谱法）7、超临界流体萃取等新兴方法。8、膜分离技术,一、常用的破碎法方法,二、离心分离技术,离心分离技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据物质颗粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同，而使物质分离的技术。,离心分离方法：1、差速离心2、密度梯度离心3、等密度离心,离心分离方法,采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法，称为差速离心。操作时，采用均匀的悬浮液进行离心，选择好离心力和离心时间
2、，使大颗粒先沉降，取出上清液，在加大离心力的条件下再进行离心，分离较小的颗粒。如此多次离心，使不同大小的颗粒分批分离。差速离心所得到的沉降物含有较多杂质，需经过重新悬浮和再离心若干次，才能获得较纯的分离产物。差速离心主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。操作简单方便，但分离效果较差。,1差速离心,密度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心，使密度不同的组分得以分离的一种区带分离方法。密度梯度系统是在溶剂中加入一定的梯度介质制成的。梯度介质应有足够大的溶解度，以形成所需的密度，不与分离组分反应，而且不会引起分离组分的凝聚、变性或失活，常用的有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系统，其梯度范围
3、是：蔗糖浓度5%60%，密度1.021.30 g/cm3。,2密度梯度离心,离心分离方法,密度梯度的制备可采用梯度混合器，也可将不同浓度的蔗糖溶液，小心地一层层加入离心管中，越靠管底，浓度越高，形成阶梯梯度。离心前，把样品小心地铺放在预先制备好的密度梯度溶液的表面。离心后，不同大小、不同形状、有一定的沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成若干条界面清晰的不连续区带。各区带内的颗粒较均一，分离效果较好。,在密度梯度离心过程中，区带的位置和宽度随离心时间的不同而改变。随离心时间的加长，区带会因颗粒扩散而越来越宽。为此，适当增大离心力而缩短离心时间，可减少区带扩宽。,将CsCl2、CsSO4等介质溶
4、液与样品溶液混合，然后在选定的离心力作用下，经足够时间的离心，铯盐在离心场中沉降形成密度梯度，样品中不同浮力密度的颗粒在各自的等密度点位置上形成区带。前述密度梯度离心法中，欲分离的颗粒未达到其等密度位置，故分离效果不如等密度离心法好。,3等密度离心,离心分离方法,应当注意的是，铯盐浓度过高和离心力过大时，铯盐会沉淀管底，严重时会造成事故，故等密度梯度离心需由专业人员经严格计算确定铯盐浓度和离心机转速及离心时间。此外，铯盐对铝合金转子有很强的腐蚀性，故最好使用钛合金转子，转子使用后要仔细清洗并干燥。,1、低速离心机，其最大转速在8000r/min以内，相对离心力在l0000g以下 2、高速离心机
5、，转速：l000025000r/min，相对离心力达l0000l00000g3、超速离心机，转速：2500080000r/min，最大相对离心力达500000g。按照分离要求，还可以进行差速离心、密度梯度离心 和等密度离心。,常用离心机的种类,离心条件的确定,离心力 离心时间（与颗粒的沉降时间有关）温度和pH值（防止欲分离物质的凝集、变性和失活）,n：转子每分钟转数，r/min,超声波在传递过程中存在着的正负压强交变周期，在正相位时，对介质分子产生挤压，增加介质原来的密度；负相位时，介质分子稀散，介质密度减小。,三、超声波萃取分离法,超声波萃取仪,超声波并不能使样品内的分子产生极化，而是在溶剂
6、和样品之间产生声波空化作用，导致溶液内气泡的形成、增长和爆破压缩，从而使固体样品分散，增大样品与萃取溶剂之间的接触面积，提高目标物从固相转移到液相的传质速率。,四、微波萃取分离法,通常，萃取溶剂和固体样品中目标物由不同极性的分子组成，萃取体系在微波电磁场的作用下，具有一定极性的分子从原来的热运动状态转为跟随微波交变电磁场而快速排列取向。,微波萃取仪,在这一微观过程中，微波能量转化为样品内的能量，从而降低目标物与样品的结合力，另一方面微波所产生的电磁场加速被萃取组分由样品内部向萃取溶 剂界面的扩散速率。缩短萃取组分的分子由样品内部扩散到萃取溶剂界面的时间，从而提高萃取速率。,原理：表面活性剂在水
7、溶液中易被吸附到气泡的气液界面上。表面活性剂极性的一端向着水相，非极性的一端向着气相，含有待分离的离子、分子的水溶液中的表面活性剂的极性端与水相中的离子或其极性分子通过物理(如静电引力)或化学（如配位反应）作用连接在一起。当通入气泡时，表面活性剂就将这些物质连在一起定向排列在气液界面，被气泡带到液面，形成泡沫层，从而达到分离的目的。,五、气浮分离法,气浮分离法,利用混合物中各组分的物理化学性质（分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一个相是固定的，称固定相，另一个相是流动的，称为流动相，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移
8、动，而达到分离的目的。,六、色谱分离技术,1、纸上色谱分离法,纸上色谱分离法原理：纸上色谱分离法是根据不同物质在固定相和流动相间的分配比不同而进行分离的。,固定相：滤纸 利用纸上吸着的水分(一般的纸吸着约等于自身质量 20 的水分)流动相：有机溶剂 操作：点样、展开、干燥、显色得到的色谱图、测定(定性和定量),纸上色谱简单装置,展开方式：上行法：展开速度慢、容易达到平衡，分离效果好 下行法：展开速度快、适用于易分离的组分分离 双向法：使用两种展开剂、90 度展开、适用于难分离的混合物的分离,比移值 Rf)：Rf a/b a 为斑点中心到原点的距离 cm b 为溶剂前沿到原点的距离 cm Rf
9、值最大等于 1，最小等于。Rf 值是衡量各组分的分离情况的数值 Rf 值相差越大，分离效果越好 使用 Rf 值定性,比移值,原理：薄层色谱分离法是将固定相吸附剂均匀地涂在玻璃上制成薄层板，试样中的各组分在固定相和作为展开剂的流动相之间不断地发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的分配过程。不同物质上升的距离不一样而形成相互分开的斑点从而达到分离。,2、薄层色谱分离法,层析缸,层析槽,1.层析槽 2.薄层板 3.垫架 4.垫板展开缸和展开槽展开,3、吸附色谱,利用吸附剂对不同物质的吸附力不同、而使混合物中的各组分分离的方法。吸附色谱分离技术是各种色谱技术中应用得最早的一类。由于吸附剂来源丰富，价格低廉，
10、易再生，装置简单，又具有一定的分辨率等优点，故至今仍广泛应用。,吸附剂与被吸附物分子之间的相互作用是由范德华力所引起的，其特点是可逆的，即在一定的条件下，被吸附物可以离开吸附剂表面，这称为解吸作用。,吸附色谱柱示意图,溶剂洗脱法：加入样品溶液后，连续不断地加入洗脱剂进行冲洗，最初的流出液为纯溶剂，然后是吸附力最弱的组分，以后逐次出现的物质是按吸附力由弱到强的顺序分别洗出，吸附力量强的物质最后洗脱出来。置换法前缘洗脱法,洗脱,溶剂洗脱液曲线,吸附剂与洗脱剂的选择,吸附剂应具有的性质：(1)吸附剂应有适当的吸附力，表面积大；(2)吸附剂对被分离物有足够的分辨力，即对不同物质的吸附力有所不同；(3)
11、吸附剂对被吸附物的吸附应是可逆的，即在一定的条件下可以解吸，以便洗脱；(4)吸附剂不会溶解在所采用的溶剂中，也不会引起被吸附物的化学改变；(5)吸附剂颗粒均匀，在操作时稳定，不会破裂。,洗脱剂应具有的性质：(1)洗脱剂不与吸附剂起化学反应，不会使吸附剂溶解；(2)洗脱剂对样品中各组分的溶解度大，粘度小，流动性好，容易与被洗脱组分分开；(3)洗脱剂的纯度要高，免受杂质影响。常用的洗脱剂有饱和烃、醇、酚、酮、醚、卤代烷以及水等。极性较大的洗脱能力较强。,4、分配色谱,分配色谱是利用各组分的分配系数不同而予以分离的方法。分配色谱中，通常采用一种多孔性固体支持物吸着一种溶剂作为固定相，另一种与固定相溶
12、剂互不相溶的溶剂可以沿固定相流动，称为流动相。当某溶质在流动相的带动下流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配，由于各物质有不同的分配系数，移动速率也就不相同，从而达到分离的目的。,分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比值。在色谱条件确定后分配系数是一常数，以K表示。,5、离子交换色谱,离子交换色谱是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团），对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种色谱分离技术，广泛应用于各种物质的分离纯化。,离子交换剂,含有若干活性基团的不溶性高分子物质，即在不溶性母体上引入若干可解离基团（活性基团）而成。不溶性母体的高
13、分子物质：苯乙烯树脂、酚醛树脂、纤维素、葡聚糖、琼脂糖或其它聚合物。活性基团可以是酸性基团：磺酸基(-SO3H)，磷酸基(-PO3H2)，亚磷酸基(-PO2H)，羧基(-COOH)，酚羟基(-OH)等。引入酸性基团的交换剂可离解出H+，与其它阳离子交换，这类离子交换剂属于阳离子交换剂。活性基团是碱性基团：季胺-N+(CH3)3，叔胺-N(CH3)2，仲胺-NHCH3，伯胺-NH2等含氨基的基团。引入含氨基碱性基团的交换剂，可与OH-结合后，与其它阴离子交换，这类离子交换剂属于阴离子交换剂。,强酸型阳离子交换剂（含有磺酸基-SO3H等）对各种正离子的亲和力次序为：Fe3+Al3+Zn2+Cu2+
14、Ni2+Co2+Fe2+Ba2+Cr2+Ca2+Mg2+Cs+Rb+K+Na+H+Li+弱酸型阳离子交换剂（含有羧基-COOH，酚羟基-OH等）对氢离子(H+)的亲和力特别高。因此转为氢型时很容易，仅需很少量的酸即可。,弱碱性阴离子交换剂对氢氧根离子(OH-)有较高的亲和力，易于转变为羟型。阳离子只能被阳离子交换剂吸附，阴离子只能被阴离子交换剂吸附；亲和力大的易于吸附，难于洗脱，亲和力小的难于吸附，容易洗脱；,强碱性阴离子交换剂（含季胺-N+(CH3)3等）对各种负离子的亲和力次序为：柠檬酸根 SO42-Cr2O4-I-NO3-CrO4-Br-SCN-Cl-HCOO-OH-F-CH3COO-,
15、离子交换剂的选择,选择离子交换剂时应考虑下列因素：(1)样品离子带何种电荷；(2)离子的浓度；(3)被分离物质相对分子量的大小；(4)离子与交换剂的亲和力大小；(5)离子交换剂及欲分离物质的物理化学特性等。,离子交换色谱的操作,离子交换剂预处理装柱 离子交换剂转型（用适当的试剂处理，便离子交换剂所带的可交换离子转变为我们所需要的离子，如阳离子交换剂用NaOH处理，可转为Na+型，用HCl处理，则转为H+型；阴离子交换剂用NaOH处理转为OH-型，用HCl处理转为Cl-型等）溶剂或缓冲液平衡上柱（加样）洗脱和收集（洗脱液中应含有与交换剂的亲和力较大的离子，以便把吸附在交换剂上的样品离子交换下来，
16、样品中含有多种离子时，与交换剂亲和力小的首先被洗脱出来）再生（再次转型）,5、凝胶色谱,凝胶色谱，又称为凝胶过滤、分子排阻色谱或分子筛色谱。它是指以各种凝胶为固定相，利用流动相中所含各物质的相对分子量不同而达到物质分离的一种色谱技术。,凝胶色谱的基本原理,当含有各种组分的样品流经凝胶色谱柱时，各组分在柱内同时进行着两种不同的运动，即垂直向下的移动和无定向的分子扩散运动（布朗运动）。大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，所以以较快的速度流过凝胶柱；而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这样就使小分子物质向下移动的速度落后于
17、大分子物质，从而使样品中各组分按相对分子量从大到小的顺序先后流出色谱柱，达到分离的目的。,Ve：洗脱体积，表示某一组分物质从加进色谱柱到最高峰出现时，所需的洗脱液体积；Vo：外体积，即为色谱柱内凝胶颗粒之间空隙的体积；Vi：内体积，即为色谱柱内凝胶颗粒内部微孔的体积。当某组分的Ka=0时（即Ve=Vo），说明该组分分子完全不进入凝胶颗粒微孔，洗脱时最先流出；若某组分的Ka=1（即Ve=Vo+Vi）时，说明该组分分子可自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，洗脱时，最后流出；若某组分的Ka在01之间，说明该组分分子介乎大分子和小分子之间，洗脱时Ka值小的先流出，Ka值大的后流出。,分配系数Ka,6、
18、亲和色谱,亲和色谱是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的一种色谱技术。具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互配的，主要的有酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅酶、抗原与抗体、DNA与RNA、激素与其受体等。在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液（流动相）中的另一方分子进行亲和色谱，达到分离纯化的目的。酶与其辅酶是成对互配的，既可把辅酶作为固定相，使样品中的酶分离纯化，也可把酶作为固定相，使样品中的辅酶分离纯化,五、超临界流体萃取技术,原理：利用超临界流体(supercritical fluid,SCF)，即其温度和压力略超过或靠近临界温度(T
19、c)和临界压力(pc)，介于气体和液体之间的流体作为萃取剂，从固体或液体中萃取出某种高沸点或热敏性的成分，以达到分离和提纯的目的。,纯物质的压温图,超临界流体萃取与液体溶剂萃取的比较,夹带剂,单一组分的超临界溶剂有较大的局限性，其缺点是：(1)某些物质在纯超临界气体中溶解度很低，如超临界CO2只能有效地萃取亲脂性物质，对糖、氨基酸等极性物质，在合理的温度与压力下几乎不能萃取；(2)选择性不高，导致分离效果不好；,(3)溶质的溶解度对温度、压力的变化不够敏感，使溶质从超临界气体中分离出来时耗费的能量增加。,针对上述问题，在纯气体溶剂中加人与被萃取物亲和力强的组分，以提高其对被萃取组分的选择性和溶
20、解度，这类物质称为夹带剂(entrainer)。例如由CO2和乙醇（夹带剂）组成的混合溶剂萃取脂肪酸，可以增加溶解度。,膜分离技术是以选择性透过膜为分离介质，当膜两侧存在某种推动力（如压力差、浓度差、电位差等）时，膜两侧组份选择性地透过膜，从而达到分离、提纯的目的。膜分离技术的出现是分离技术的一个飞跃，丰富了分离手段，大大提高了过滤效率及过滤效果。通过引入膜分离技术可以替代离心、沉降、蒸发、吸附等传统的分离手段，提高生产效率、降低运行成本、简化操作。,六、膜分离技术,动植物体内可能存在的主要成分及其大小,目前，以压力作为推动力的膜分离过程共有四种，以过滤孔径由小到大的顺序排列依次是：反渗透、纳
21、滤、超滤、微滤。,1、微滤（MF）,微滤可有效去除物料中的悬浮固体、细菌、胶体及固体蛋白。一般有0.1um至2um孔径的微滤膜。如果采用无机的膜材料，如不锈钢管式的微滤膜，还具有以下特点：化学稳定性好，适用于pH2-14的过滤环境。机械强度高，可承受10个大气压的内、外压，并可反向冲洗。抗微生物能力强，不与微生物发生作用，可以在生物工程及医药科学领域中应用。耐高温，可使用蒸汽直接消毒、灭菌。孔径分布窄，分离效率高，产品质量好，收率高，生产消耗低。膜使用寿命长（7-8年），运行、清洗方便。通量恢复彻底（耐高温、强碱性能）。,2、超滤(UF),超滤是根据物料组份分子量的大小对溶液进行选择性的分离，从而实现溶液纯化、分离或浓缩等目的。分子量的范围由几千至几百万不等。主要应用于酶、蛋白质、多肽、细胞、病毒及多聚糖的纯化和浓缩，以及抗生素发酵液的澄清、脱色等领域。管式、中空纤维、卷式,3、纳滤(NF),纳滤可以截留分子量大于150-200的物质，而部分无机盐、小分子有机物和水则可以通过。利用纳滤膜的这一特性，可以将其应用于化学药品的浓缩及脱盐的过程中。纳滤（NF）膜介于RO与UF膜之间，对NaCl的截留率较低，只对特定的溶质具有高脱盐率；如对钙、镁离子的截留率达96%以上，并可以有效去除水中含有的三卤甲烷中间体THM（加氯消毒时产生），用于饮用水的净化、软化。,纳滤软化单元,
