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1、金黄色葡萄球菌的致病性及检测技术,2016/6/16,简介,金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属（Staphylococcus），有“嗜肉菌的别称，是革兰氏阳性菌，可引起许多严重感染。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37C，最适生长pH7.4，干燥环境下可存活数周。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径0.51.0mm。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物、青霉素、红霉素、土霉素、新霉素等抗生素敏感，但易产生耐药性，对碱性染料敏感。,流行病学,美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄
2、球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则占到45%。中国金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件也时有发生。2002年，澳大利亚一次公众活动因前一天准备的食物贮存不当导致250人出现恶心、呕吐、胃痉挛的症状，其中100多人因为脱水需要进医院治疗。2001年4月12日，无锡市锡山区所辖小学、幼儿园因课间加餐饮用袋装牛奶饮料导致食物中毒事件。2000年6月底到7月中，日本有14555人被感染，感染源来自日本当时最大的牛奶生产商雪印乳业。1997年，美国佛罗里达31人食用被污染的火腿片被
3、感染，症状持续了大约24小时。,金黄色葡萄球菌流行病一般多见于春夏季。中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位，常成为污染源。金黄色葡萄球菌可引起局部化脓感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌为侵袭性细菌，能产生毒素，对肠道破坏性大，金黄色葡萄球菌肠炎起病急，中毒症状严重，主要表现为呕吐、发热、腹泻。,金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：a.溶血毒素：外毒素，分、四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死b.杀
4、死白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关,d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C1、C2、C3、D、E及F八种血清型。肠毒素可耐受100C煮沸30分钟而不被破坏。它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。,检测与诊断,标本采集 采自不同感染部位的
5、各种标本，包括血液、脑脊液、穿刺液；痰液、脓液、创伤分泌物、尿液、粪便和呕吐物等。直接涂片镜检 直接涂片检查在正常情况下呈无菌状态的体液标本如血液、脑脊液、穿刺液等，若有检出革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列、无芽胞、荚膜，直径0.5-1m的球菌。即具有重要的临床价值。,分离培养 可以选用普通营养琼脂平板、血平板和高盐甘露醇平板，血平板用葡萄糖肉汤增菌培养基。该菌在普通肉汤中呈均匀迅速混浊生长；若接种于琼脂平板上35过夜后可形成直径约23mm的厚菌落、湿润有光泽、呈金黄色不透明圆形凸起。若接种于血平板，菌落周围可形成明显的透明的溶血环。在高甘露醇平板上金黄色葡萄球菌生成淡橙黄色菌落，以此可与其他
6、凝固酶阴性的葡萄球菌相鉴别。,鉴别实验一、血浆凝固酶试验血浆凝固酶是金黄色葡萄球菌所产生的，与其致病力有关的一种侵袭性酶，其作用是使血浆中的纤维蛋白在菌体表面沉积和凝固以阻碍吞噬细胞的吞噬。血浆凝固酶分为结合型和游离型。前者结合在细菌的细胞壁上，能直接作用于血浆中的纤维蛋白原，使之转化为纤维蛋白，环绕菌体而形成凝块。而游离型血浆凝固酶则在产生后被分泌到菌体外，不能直接作用于纤维蛋白原，但可以激活血浆凝血酶原，使之转化成凝血酶，后者再作用于纤维蛋白原使其转化为纤维蛋白。具体的测量方法也因此分为玻片法和试管法两种。,1、玻片法：将待试菌落乳化于玻片上的盐水中，经1020S证实无自凝后，用接种环取人
7、或兔血浆一环，与乳化菌液混合，出现凝集者为阳性，另设生理盐水为阴性对照。2、试管法：吸取0.5mL兔血浆与0.5mL金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤24小时培养物充分混匀，置37培养，每隔半小时观察一次，连续观察6小时，出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容物不流动，判为阳性。,二、耐热核酸酶试验将24小时肉汤培养物沸水浴处理15min，用接种环划线刺种于甲苯胺兰-DNA平板，35培养24小时，在刺种线周围出现淡粉色者为阳性。本试验金黄色葡萄球菌为阳性。三、甘露醇发酵实验金黄色葡萄球菌可发酵甘露醇。四、Staphaurex 胶乳凝集实验是鉴定金黄色葡萄球菌的一种快速、简便的商品化直接凝集试验。其基本原
8、理是在纸片上滴加包被有纤维蛋白原和IgG抗体的聚苯乙烯胶乳，然后用接种环挑取待鉴定菌株的新鲜培养物加入混匀，若出现凝集块现象即为阳性。,生化鉴定如上述，注意与其他凝固酶阳性的葡萄球菌的鉴别要点：PYR（吡咯烷酮-萘基酰胺试验阴性；VP试验阳性；鸟氨酸脱羧酶试验阴性。免疫学方法用酶联免疫吸附试验和对流免疫电泳方法可检测金葡菌的磷壁酸抗体。分子生物学方法包括PFGE脉冲场凝胶电泳以及酶切图谱分析等。,定量检测方法,目前关于食品中金黄色葡萄球菌的定量检测方法主要有Baird-Parker平板计数法、显色培养基计数法、Petrifilm TM 测试片计数法、MPN计数法、酶联免疫吸附法、反相被动乳胶凝
9、集法、放射免疫测量法、反相血凝实验、纤维玻片凝胶双扩散法、聚合酶链式反应技术等。,显色培养基A计数法：稀释好的菌液0.2 mL涂布接种培养基平板上，361培养24 h，按说明书判读，可疑菌落做补充实验（血浆凝固酶试验，目标菌落血浆凝固酶试验为阳性）。显色培养基B计数法：稀释好的菌液0.2 mL涂布接种培养基平板上，361培养24 h，按说明书判读，可疑菌落做补充实验（滴加1 mol/L盐酸，目标菌落有透明圈）。,Petrifilm TM 测试片计数法：稀释好的菌液1 mL接入测试片，静置测试片1 min，361培养24 h，按说明书判读，必要时对可疑菌落用确认反应片做补充实验。金黄色葡萄球菌在显色培养基A上的生长率最高，PetrifilmTM测试片的选择性最强，4种计数方法的检出限相当，检出结果与实际含菌量无显著差异。结论：选择显色培养基作为日常检验的辅助手段可大大提高检测灵敏度、缩短检验周期、节约检验成本，值得在日常检验中推广应用。,谢谢观看！,
