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1、化学药品杂质的控制与案例分析,周立春,主要内容,杂质的定义与分类杂质的检测方法杂质检查方法的建立与验证,杂质的定义及分类,定义：任何影响药品纯度的物质。分类：一、按化学特性分类：有机杂质、无机杂质、有机挥发性物质。二、按来源分类：有关物质（反应前体、中间体、副产物、降解产物等）、其它杂质、外来物质。三、按结构分类：其他甾体、其他生物碱、几何异构体、光学异构体和聚合物。,药典中的分类方式,杂质的检测方法,物理常数测定法 旋光度-检查具有光学活性的杂质紫外分光光度法 杂质吸光度-在特定波长具有紫外吸收的杂质容量滴定法 游离脂肪酸、过氧化物、还原糖重量法 酸中不溶物、水中可溶物 比色比浊法 游离淀粉
2、、碘化物、铁盐、氯化物、硫酸盐等,杂质的检测方法,原子吸收分光光度法：检查金属杂质毛细管电泳法：抑肽酶中检查去丙氨酸-去甘氨酸-抑 肽酶和去丙氨酸-抑肽酶两个特定杂质 色谱法：液相色谱法，检查有机杂质的主要方法 薄层色谱法，作为液相色谱法的补充 气相色谱法：检查挥发性杂质热分析法：检查不同晶型的杂质（影响生物利用度和 稳定性）拉曼光谱法、红外光谱法、X-射线粉末衍射生物检定法、酶联免疫试剂盒（抗生素残留量）,残留溶剂控制,标准起草过程中，应针对所用到的有机溶剂进行检查建议采用了顶空进样方式和程序升温梯度洗脱的方法，应注意供试品溶液的配制，要求供试品在溶剂中溶解。方法学试验应进行回收试验，确认是
3、否有基质干扰。采用标准加入法，该方法可减少基质干扰，提高方法的准确度。关于校正相对保留时间（RART）的应用。,残留溶剂检测的常见问题：,共出峰干扰 热降解干扰 基质效应的影响 药品溶解性的影响 溶剂介质的影响,共出峰干扰,共出峰：在相同的色谱条件下具有相同保留值的组分不一定是同一物质。不同的物质在某一色谱条件下具有相同保留值的现象，被称为共出峰现象。不同物质在性能（极性或氢键形成能力等）不同的色谱柱中具有完全相同保留行为的几率很小。因此采用不同极性的色谱柱分别测定，可以排除共出峰的干扰。,吡柔比星中正己烷共出峰的排除,热降解干扰,如果药品对热不稳定，则可能会在直接进样或顶空加热过程中发生热降
4、解，如果降解产物恰好与待测的有机溶剂共出锋，或恰好就是某种有机溶剂，则会导致把降解产物当作残留溶剂检测，得出错误结果。,热降解原因,分子结构中有烷氧基的药品可能热解产生相应的醇。,排除干扰的办法,改变顶空温度可以确定顶空条件下样品是否能产生热降解干扰物。也可以通过测定已知不含该溶剂的对照样品来加以判断。,基质效应的影响和排出,基质效应顶空分析时，因对照品溶液和供试品溶液的组成不同，使得待测挥发性组分在气液两相间的分配系数不同引起的定量误差。标准加入法可以有效地排除基质效应的影响；当标准加入法结果与内标法结果系统偏差约10%（通常偏低）时，可以认为方法存在明显的基质效应。,内标法与标准加入法测定
5、结果的比较,药品溶解性的影响,当样品在溶解介质中未溶解时，测定结果通常偏低且精密度差。如待测溶剂为水溶性不好的溶剂，且选择水为溶媒时，可先用少量乙醇或甲醇溶解待测溶剂后再用水稀释的方法配制对照品溶液。,供试品溶液的制备,对水溶性药品，采用水为溶剂；当药品不溶于水，但可溶解于一定浓度的酸或碱溶液中时，可采用酸或碱溶液作为溶剂；对于非水溶性药物，可采用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、DMSO等为溶剂。,溶液的配制应注意问题：,1、为了避免残留溶剂挥发，不可用超声或加热方式溶解样品。如果采用顶空进样，样品置顶空瓶并封盖之后可以超声或加热溶解样品。2、大颗粒样品不可以研磨取样，只能取原态样品（或冷冻粉
6、碎）。,溶解介质的影响,当药品在某种溶解介质中溶解后，待测溶剂或内标可能与药品产生较强的相互作用，以至采用标准加入法也无法排除对测定结果的影响。,头孢呋辛酯在不同溶剂介质中对正己烷残留量测定的影响,以1mol/L NaOH溶液为溶剂介质时，尽管对照品溶液与供试品溶液中内标丁酮的浓度相同，但是其峰面积却相差一倍；而溶剂介质为DMF时，相同浓度的丁酮内标在对照品溶液和供试品溶液中的峰面积几乎相同。,以1mol/L NaOH溶液为溶剂介质时，利用内标法得到数据与标准加入法得到数据，计算对照品（正己烷）的回收率，发现对照品的回收率约为50%，超出方法可接受的范围（80-120%）。,药物研发中残留溶剂
7、研究存在问题：,表述不全面或不准确。对色谱图中出现的未知峰未进行研究。试验条件未进行考察。方法学验证不全面。,无机杂质的控制,无机盐来源：来自工艺、原料或降解产物主要控制项目有：氯化物、硫酸盐、硫化物、氰化物、磷酸盐、溴化物、碘化物、重金属等,Company Logo,供试品溶液的配制,标准溶液的最佳显色量,限度的确定,无机杂质的控制,1,3,2,无机杂质限度试验计算方法,主要参数：限度、取样量（W）、对照溶液浓度（C）和对照溶液用量（V）。公式 C（g/ml）V（ml）限度=100%W（g）,有关物质控制,有关物质要求概述所有品种都应进行有关物质的考核对杂质进行定性研究，确定结构，从而为实现
8、对已知杂质和未知杂质的区别控制，同时也为科学制订检查方法的系统适用性要求提供基础保障。优化方法（增加有效的系统适用性试验要求）限度合理,有关物质的来源,起始原料中间体、副产物降解产物聚合物异构体多晶型杂质,有关物质控制,有关物质关于分离及检测方法,ICGCCEPC,一般采用色谱法TLCLC（反相、正相、凝胶）,有关物质控制,有关物质关于分离及检测方法色谱柱原则：方法验证时进行粗放度试验（三根以上色谱柱），特殊填料应在各论中予以注明，强调“或效能相当”。大多为反相高效液相法，采用C18、C8、苯基等键合硅胶填料，以C18为最常用；目前C18色谱柱类型也很多，不同基质、不同载碳量、不同封端处理方式
9、、不同纯度、不同粒径、孔径、柱长等，影响因素较多，方法研究时应注意粗放度考察；,色谱柱的差异,低金属不纯物的含量,有关物质控制,有关物质关于分离及检测方法色谱柱也有采用分子排阻色谱法，有的采用亲水改性硅胶；例：头孢地嗪钠有关物质，以球状蛋白色谱用亲水硅胶（分子量适用范围为100010000）为填充剂还有的采用离子色谱法，采用离子色谱填料。例：氯膦酸二钠及注射剂，采用阴离子交换色谱柱（推荐使用IonPac AS11-HC，或效能相当）,例：离子色谱（氯膦酸二钠）,照离子色谱法试验用阴离子交换色谱柱（推荐使用IonPac AS11-HC，或效能相当），柱温30以水为流动相A，以0.1mol/L氢氧
10、化钾溶液为流动相B，梯度洗脱，流速为1.2 ml/min。检测器为电导检测器，检测方式为抑制电导检测。,氯膦酸二钠原料药的有关物质与制剂的含量测定,有关物质控制,有关物质关于分离及检测方法流动相在保证灵敏度的前提下，一般采用等度洗脱；必要时可采用梯度洗脱方式（如：多杂质组分的分离，等度洗脱分离效果不佳；或杂质性质相差较大，等度洗脱时间过长，损失灵敏度）例：法莫替丁氯化钠注射液流动相以挥发性流动相为好，一般情况下尽量不加离子对试剂。,法莫替丁氯化钠注射液（有关物质）,原国家标准方法等度洗脱结果：23.6%,2010年版方法梯度洗脱结果：28.3%,液相色谱常用检测器,光学检测器：紫外、荧光、示差
11、折光、蒸发光散射（通用型检测器）电化学检测器：极谱、库仑、安培电学检测器：电导、介电常数质谱检测器选择性检测器：灵敏度较高,2010版药典二部采用检测器情况,有关物质控制,有关物质关于分离及检测方法检测器一般采用紫外检测器：波长的选择更加关注杂质的最大吸收或最佳检测参数，以提高杂质的检测灵敏度。难以兼顾各杂质可选择多波长检测部分品种采用蒸发光检测器：谨慎选用蒸发光检测器，必要时对主要实验参数进行描述。,有关物质检测波长的确定,头孢地嗪通过采用DAD检测器在不同检测波长检测各种破坏试验的杂质变化情况，发现有的杂质在215nm和262nm的紫外吸收不同。在215nm的吸收与主峰的吸收接近，因此检测
12、波长定在215nm。,破坏试验不同波长的杂质变化,头孢地嗪的紫外吸收图,杂质之一的紫外吸收图,蒸发光散射检测器,优点适用于没有特征紫外吸收或紫外吸收很弱的待测物，使用UV时灵敏度更低；无需衍生化而直接测定，避免了衍生带来的误差。可以应用有强紫外吸收的试剂，如氯仿、丙酮等。适用于组分复杂样品的分析，可以进行梯度洗脱，基线平稳。通用型检测器，只要待测物挥发性低于溶剂，即可适用。对不同物质，ELSD相应因子的变化比其它检测器要小得多。对环境影响不灵敏，室温下即可操作。没有溶剂前缘峰，适用于保留时间短的物质的检测。与LC-MS的色谱条件一致，可直接进行方法转换。,蒸发光散射检测器,影响ELSD响应的因
13、素载气流速、雾化器设计与温度、流动相的组成和流速等影响雾化过程。被分析物的浓度和体积质量决定了进入光散射池的气溶胶中的颗粒的直径。被分析物的折射指数、光源发出的光的强度和波长、光电倍增管的位置等影响散射光强度。光电倍增管的灵敏度和入射光的强度决定了检测的效率，反映为实验者所观测的峰面积。,蒸发光散射检测器,硫酸核糖霉素有关物质色谱图（蒸发管温度：65，分流模式）,蒸发光散射检测器,硫酸核糖霉素有关物质色谱图（蒸发管温度：110，不分流模式）,关于物料平衡的概念,百度中的名词解释：系指在药品生产过程中,同批产品的产量和数量所应保持的平衡程度。如有显著误差,必须查明原因,确认无潜在质量事故后,方可
14、按正常事故处理,物料平衡是产品质量的检验性指标。在液相检测有关物质时的物料平衡：应该是指经过各种破坏试验后，主成分峰面积的减少与杂质峰面积的增加之间的平衡，以确定检测方法的准确性。,有关物质控制,有关物质关于系统适用性试验要求：分离度2010年版加强了对分离度的要求，通过分离度的限制来保证分离的重现性。要求杂质和主成分、杂质之间的分离度均要得到良好保证。（1）采用杂质对照品溴丙胺太林：呫吨酸、呫吨酮、9羟基溴丙胺太林与溴丙胺太林峰之间的分离度均应符合要求；尼莫地平：杂质I与主峰分离度应大于3.0；枸橼酸氯米芬有关物质中要求其顺反异构体的分离度不得低于1.3。,例：有关物质（溴丙胺太林）,有关物
15、质控制,有关物质关于系统适用性试验要求：分离度（2）采用混合对照品采用纯度稍差但杂质组分组成与比例相对稳定的原料药，可以较好地保证分离的重现性。关键在于对照品的提供。例：氯碘羟喹,有关物质控制,氯碘羟喹系统适用性试验色谱图,有关物质（关于系统适用性试验要求：分离度）,有关物质控制,有关物质关于系统适用性试验要求：分离度（3）通过化学处理或其它降解方式产生杂质（注意：反应条件的优化与重现）例1：盐酸甲氯芬酯通过水浴加热，产生水解产物峰，该峰（相对保留时间0.6）与主峰分离度应大于6.0；例2：戊酸雌二醇称取戊酸雌二醇对照品10mg，在160烘箱中加热2小时后，用乙腈溶解并稀释至25ml，摇匀，量
16、取10l注入液相色谱仪，戊酸雌二醇与降解产物（相对保留时间约为0.92）的分离度应符合规定。,有关物质控制,戊酸雌二醇系统适用性试验色谱图（戊酸雌二醇tR=9.466，降解物tR=8.723，分离度Rs=1.5）,有关物质（关于系统适用性试验要求：分离度）,有关物质控制,有关物质关于系统适用性试验要求：分离度（4）采用其它方法制备系统适用性试验用样品（如：采用结构性质相近的指标性物质）例：茶碱，采用茶碱和可可碱配成溶液作为系统适用性试验溶液，要求两者的分离度大于2.0。,有关物质控制,有关物质关于系统适用性试验要求：分离度（5）采用相对保留时间定位（如果无法长期获得该杂质对照品时）应特别注意色
17、谱条件的耐用性考察如能在标准中列出主成分的保留时间、色谱柱尺寸，可增强此法的可操作性。在梯度洗脱的色谱系统中为保证方法的重现性，应对主峰的出峰时间进行规定。例：己酮可可碱通过梯度洗脱，在系统适用性试验中不仅规定相关杂质的分离度，同时规定己酮可可碱的出峰时间为12分钟。,有关物质控制,有关物质关于系统适用性试验要求：拖尾因子对于在色谱系统中峰形非对称的色谱峰规定该色谱峰的拖尾因子是很有意义的，以保证色谱峰不会因拖尾严重，而导致杂质峰包裹在主峰中未被检出。例：马来酸依那普利的色谱条件中，除规定相关杂质的分离度外，同时规定依那普利峰的拖尾因子不得过2.0。,有关物质控制,有关物质关于系统适用性试验要
18、求：灵敏度试验通过配制灵敏度试验溶液（主成分浓度一般与报告限一致），并规定灵敏度试验溶液中主成分的信噪比，可以更好地保证方法的重现性、灵敏度和测定结果的准确性。例：紫杉醇对照溶液（2）（相当于0.1%）主成份峰的信噪比应不小于10。,有关物质控制,有关物质关于系统适用性试验要求：报告限通过规定小于对照溶液主峰面积的一定量的色谱峰可忽略不计，可保证积分参数设置的合理性和一致性。例：甘露醇供试品溶液的色谱图中，任何小于对照溶液主峰面积的0.05倍的峰可忽略不计。例：十一酸睾酮 供试品溶液色谱图中，任何小于对照溶液主峰面积0.02倍的色谱峰可忽略不计。,ICH新原料药中的杂质指导原则,ICH规定的杂
19、质报告限鉴定限论证限,有关物质控制,有关物质关于定量方法（1）杂质对照品外标法：采用杂质对照品，按外标法计算，应注意该杂质线性范围的考察。（注意：如引入了定量杂质对照品，则该杂质对照品的质量应满足定量要求。）例：荧光素钠间苯二酚（杂质）、邻苯二甲酸（杂质）例：对氨基水杨酸钠间氨基酚例：地塞米松倍他米松,有关物质控制,有关物质关于定量方法（2）加校正因子的自身对照法：若仅在实验过程中可提供相应质量和数量的杂质对照品，而长期提供符合要求的杂质对照品难度较大，则考察该杂质相对于主成分的校正因子。（用于测定校正因子的杂质对照品应按定量对照品的要求进行标化），采用加校正因子（超出）的主成分自身对照法进行
20、检查。,相关术语的定义,响应因子（K）：当检测器输出的信号与被测物质的浓度呈线性响应时，检测器输出的信号（A）与被测物质的浓度（C）的比值即为响应因子。K=A/C校正因子(F):响应因子的比值 F=K1/K2,有关物质控制,有关物质关于定量方法（3）不加校正因子的主成分自身对照法：大多数品种采用了这种方法对杂质进行控制。（4）峰面积归一化法：2010版化学药品中很少使用，在保证0.1%或0.05%、甚至更低含量的杂质能被检出的情况下，主成分浓度就会很高，如采用该法应考虑最小组分和最大组分的检测响应是否在主成分的线性范围内。谨慎使用。例1：大豆油（供注射用）脂肪酸组成例2：甘油二甘醇、乙二醇与其
21、他杂质,有关物质控制,有关物质气相色谱法填充柱改毛细管柱，等温洗脱改程序升温，增加了系统适用性要求例1：壬苯醇醚（游离环氧乙烷）分离度例2：甘油（二甘醇、乙二醇与其他杂质）分离度、重复进样精密度,有关物质控制,有关物质薄层色谱法优化方法，分离度试验和灵敏度试验例1：司坦唑醇与美雄诺龙分离度例2：苏氨酸（其他氨基酸）供试品溶液（10mg/ml)对照溶液(0.05mg/ml)灵敏度测试溶液(0.02mg/ml)混合对照品溶液（苏氨酸和脯氨酸）分离度规定：灵敏度测试溶液应显一个明显斑点，混合对照品溶液中应显两个清晰分离的斑点，供试品溶液除主斑点外所显杂质斑点的个数不得超过1个，其颜色与对照溶液的主斑
22、点比较，不得更深（0.5%）。,有关物质控制,有关物质关于限度理论上讲，应该根据杂质的毒性、用药量等多种因素综合考虑，但由于缺乏对杂质的基础性研究，故一般国内产品质量能达到欧美要求的，基本上与其保持一致。另结合样品稳定性考察情况综合制定。,原料药有关物质的分析方法,方法学要求：1）专属性：a、已知杂质：可采用在供试品中加入杂质对照品的方式。b、未知杂质：用含有杂质的样品进行测定，如粗品和母液。采用破坏方式检测，如强光、酸、碱、高温、高湿或氧化反应等方式。必要时用二极管阵列或质谱检测，进行纯度检查。,原料药有关物质的分析方法,2）检测限和定量限：目视法和信噪比法。信噪比法：检测限的信噪比应大于3
23、：1。定量限的信噪比应大于10：1。3）线性范围：一定要涵盖全部测定浓度，特别是面积归一化法。,原料药有关物质的分析方法,4）准确性和重复性试验：针对已知杂质，采用杂质对照品法。5）耐用性：应考察因素：被测溶液的稳定性、样品提取次数、时间、流动相的组成和pH值、色谱柱、柱温和流速等。,原料药有关物质的分析方法,建立方法应采用几种不同的分离方法或不同测试条件，以便对比结果，选择较佳的方法。应考虑方法普遍适用性，所使用的仪器和试剂易于获得特殊试剂应在质量标准中说明。,制剂有关物质控制的关注点,降解产物原料药杂质谱与制剂杂质谱差异活性成分与辅料、其他有效成分（复方制剂）的相互作用活性成分与包材的相互
24、作用（如浸出物）长期稳定性数据,降解产物,从结构分析可能产生的降解产物 酒石酸美托洛尔头孢吡嗪,原料药杂质谱与制剂杂质谱差异,与辅料及其他有效成分的相互作用,关注专属性试验：原料的专属性试验 原料加其他组份的专属性试验 比较并分析处方的合理性（阿奇霉素干混悬剂）,活性成分与包材的相互作用,工艺确定后的包装材料浸出物的测定。工艺变更后的包装材料浸出物的测定。变更包括：加工步骤性质的改变（更长的时间、更高的温度）增加-减少某个加工步骤（如清洗）采用的工艺类型的变更（伽马射线与电子束）新的加工助剂操作参数的变更新材料的使用同样材料的不同配比新的形状和结构,稳定性试验的启示,应重点关注：在加速试验中不
25、断增长的杂质 长期稳定性试验中不断增长的杂质 工艺变更后不断增长的杂质 改变包装后不断增长的杂质 各种异常情况,辅料干扰的解决方式,干扰较小，不再要求排除。有干扰与溶剂接近，以溶剂峰为标识。干扰比较靠前，且专属性试验和稳定性数据显示，在辅料峰前没有杂质峰，可以采用相对保留时间的方式。有明确的辅料峰，可以采用配空白溶液的方式标识。国家局有明文规定，辅料峰可以扣除，采用全方位对比。,研究资料中存在问题,1）供试品溶液的配制应注意的问题：提取情况（加热、超声等）、称样量较大情况等。2）注意检测波长的选择，应针对待检测杂质。3）供试品溶液稳定性问题，见光分解问题,研究 资 料中存在问题,4）图谱不全（特别是溶剂峰）。5）未提供限度依据。如限度较宽的情况下，没有充足的理由。6）方法学试验不完整，缺少必要的试验数据。7）没有充分利用稳定性试验数据，对有关物质的限度制定提供有力的依据。,研究资料中存在问题,8）对主要杂质缺少结构上的归属，缺少限度上的要求。9）文字上的问题,谢谢大家！,联系方式：邮箱：电话：,
