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1、Chromatography,第二章 色谱分析法,一、色谱分离理论基础,问题问题1：什么是色谱法？问题2：为什么色谱法能将混合物分开？问题3：色谱法的分类？问题4：各种色谱法的应用范围？,1、色谱法概述,茨维特的实验,茨维特()：俄国植物学家，主要从事植物色素的研究工作色谱之父,1901一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用1906 年发表的文章中，首次提出了色谱的概念。,利用混合物中不同组分在两相之间进行不同分配的原理，使混合物分离，并进行定性和定量分析的方法。,色谱法是一种分离方法。它的特点是：有两相，一是固定相，一是流动相，两相作相向运动。将色谱法用于分析中，则称为色谱分析。色谱分析是一
2、种分离、分析法。,色谱的发展,液固色谱Tiselius和Claesson，瑞典科学家，改进色谱方法，1948年诺贝尔化学奖,A.W.K.Tiselius19021971,分配色谱Martin和Synge，英国科学家，提出分配法，1952年诺贝尔化学奖气相色谱Martin和James，1951年通过实验证明气液色谱可行性。,A.J.P.Martin19102002,R.L.M.Synge19141994,2、色谱法分离原理,当流动相中所携带的混合物流过固定相时，会和固定相发生作用。由于混合物中各组分在性质和结构的差异，与固定相之间作用力的大小也有差异。因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的
3、滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出。,3、色谱法的分类,按流动相状态的不同，可分为气相色谱法(GC)液相色谱法(LC)超临界流体色谱(SFC),气相色谱法,以气体为流动相的色谱法（Gas Chromatogaphy）按固定相状态的不同可分为：气固色谱(GSC)气液色谱(GLC)适合分离分析易汽化，稳定、不易分解、不易反应的样品，特别适合用于同系物、同分异构体的分离。,液相色谱法,以液体为流动相的色谱法（Liquid Chromatogaphy）按固定相状态的不同可分为：液固色谱(LSC)液液色谱(LLC)适合分离分析高沸点、热不稳定、离子型的样品。,按固定相使用的形式可分为,
4、柱色谱（Column Chromatography）将固定相装在色谱柱内纸色谱（Paper Chromatography）用滤纸做固定相或固定相载体的色谱薄层色谱（Thin Lay Chromatography）固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上,按分离过程作用原理可分为,吸附色谱分配色谱离子交换色谱排阻色谱,4.色谱相关术语,色谱仪的一般组成,关于色谱图的术语,峰,峰高,基线,峰宽Y,半峰宽Y1/2,峰面积,标准偏差,基线无组分时色谱流动相所产生的信号随时间变化的曲线（直线）基线漂移基线定向的缓慢变化基线噪声基线随机的起伏,标准偏差0.607倍峰高处的峰宽的一半半峰宽Y1/2峰高一半处的峰宽：Y
5、1/2=2.354峰底宽度Y色谱峰两侧转折点切线在基线上的截距：Y=4,死时间(tM):无保留组分出峰时间保留时间(tR):流出色谱柱的组分浓度最高的时间调整保留时间(tR):死体积(VM):保留体积(VR):调整保留体积(VR):,关于保留值的术语,相对保留值(ri,s或a):保留指数(I)：规定正构烷烃的保留指数是其碳数的100倍，其它物质的保留指数在实际色谱条件下测定。选取保留值与被测物相邻的两种正构烷烃做参照系，其中一种碳数为Z，另一种为Z+1，被测物的保留指数由下式计算：,分配系数K(distribution coefficient)分配比k（容量因子、容量比），是指在一定温度和压力
6、下，平衡状态时组分在固定相中的量与在流动相中的质量的比值。是衡量柱子对组分保留能力的重要参数。,关于分配平衡的术语,相比 色谱柱内固定相和流动相体积之比 相比是柱型及结构的重要特征。,滞留因子RS 色谱柱中样品流速与流动相流速之比,二、色谱分析法基本理论,研究理论的目的解决色谱峰的分离问题三个色谱基本理论问题色谱热力学问题发展高选择性色谱柱色谱动力学问题发展高效能色谱柱分离条件的最优化问题分离条件优化,1、色谱动力学理论,研究流出曲线展宽的本质及曲线形状变化的影响因素塔板理论速率理论,（1）塔板理论,基本假设色谱柱可分为许多完全相同的小段，每一段中达到分配平衡所需的时间可忽略，每一段的长度称为
7、塔板高度H；流动相进入色谱柱时为脉冲式而不是连续式，每次进一个板体积的流动相；待测样品开始时位于第0号塔板上，并且不会沿色谱柱方向扩散；每个塔板上的分配系数相同；,色谱峰的产生,设色谱柱有5个塔板，分配系数为1，,对流出曲线进行拟合，通过概率理论得到流出曲线方程：,-标准偏差其中：C0-初始浓度tR-保留时间,当t=tR时，C=Cmax，峰高正比于进样量C0，是峰高定量的理论基础。当n越大，Cmax/C0越大。即保留时间一定时，塔板数越多，峰越高。Cmax反比于tR，tR小，Cmax大，保留时间小的组分峰高且窄；tR大，Cmax小，保留时间大的组分峰低且宽。,对色谱流出曲线方程的讨论,柱效,由
8、流出曲线方程导出：n，H，n有效，H有效，柱效指标,t一定时，Y，Y1/2与n成反比，n越大，峰越窄，分离效果越好；n越大，H越小，表明组分在柱中达到的分配平衡次数越多，对分离越有利，但还不能预言各组分有被分离的可能性；相同的色谱柱对不同物质的柱效不同！,塔板理论的贡献,塔板理论有助于我们形象的理解色谱的分离过程。导出色谱流出曲线方程，它符合高斯分布，与实验现象相吻合。导出理论塔板数的计算公式，作为柱效的评价指标。,塔板理论的局限,塔板高度H是一个抽象的物理量，它的色谱本质是什么？它与哪些参变量有关，又怎样影响峰的扩张？对实验的指导意义有限。不能解释流速对理论塔板数的影响。没有考虑纵向扩散，分
9、配系数的变化，达到平衡所需的时间。,（2）速率理论,速率理论是1956年荷兰学者Van Deemter等提出，因此又称作范第姆特方程。运用流体分子规律研究色谱过程中产生色谱峰扩展的因素，导出了理论塔板高度与流动相线速度的关系，揭示了影响塔板高度的动力学因素。,气相色谱速率方程,速率理论讨论的是色谱峰展宽原因，即影响塔板数n的因素，即影响塔板高度H的因素。速率方程的一般形式：H=A+B/u+CuA-涡流扩散项B-分子扩散项C-传质阻力项u-流速,涡流扩散项A,由不等路径造成的色谱峰扩展。由于柱填料粒径大小不同，粒度分布范围不一致及填充的不均匀，形成宽窄、长短不同的路径，因此流动相沿柱内各路径形成
10、紊乱的涡流运动，有些溶质分子沿较窄且直的路径运行，以较快的速度通过色谱柱，发生分子超前，反之，有些分子发生滞后，从而使色谱峰产生扩散。,涡流扩散项,均匀性因子,粒径,分子扩散项B/u,由于分子的纵向扩散造成的色谱峰扩展。由于试样组分被载气带入色谱柱后，是以塞子的形式存在于色谱柱的很小一段空间中，由于在塞子前后存在浓度梯度，因此使运动着的分子产生纵向扩散，引起色谱峰扩展。,扩散系数,弯曲因子,传质阻力项Cu,由气相传质阻力和液相传质阻力两项组成,气相传质阻力项Cgu,试样组分从气相移动到固定相表面的过程中，由于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使分子有滞留倾向。在此过程中，部分组分分子随流
11、动相向前运动，发生分子超前，引起色谱峰扩展。,容量因子,液相传质阻力项Clu,试样组分从固定相表面移动到固定相内部的过程中，由于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使分子有滞留倾向。在此过程中，部分组分分子先离开固定相表面，发生分子超前，引起色谱峰扩展。,液膜厚度,液相扩散系数,气相色谱中的速率方程,速率方程的意义,为柱型的研究和发展提供理论依据为操作条件的选择提供理论指导为色谱柱的填充提供理论指导,对柱型研究和发展的影响,消除涡流扩散项A=0?Golay1957年提出毛细管柱（opentube）的概念毛细管柱A=0，H=B/u+CuH，N，分离能力大大提高,对柱型研究和发展的影响,消除分
12、子扩散项B=0?溶质在液体中的扩散系数DL10-5cm2/s溶质在气体中的扩散系数Dg10-1cm2/sDL 0.5 cm/s)液体作流动相时可用更细的固定相，A HPLC柱效比GC要高23个数量级,操作条件对柱效的影响,H-u 曲线,载气线速度（流速）的影响,最佳流速：u=(B/C)1/2最小塔板高度：Hmin=A+2(BC)1/2实用最佳流速：比最佳流速更快A与流速无关当流速小时，B/u对H的大小起主导作用当流速大时，Cu对H的大小起主导作用,对色谱柱的填充提供理论指导,柱径：柱径越小，固定相越难填充均匀。柱长L：柱长增加，总塔板数增加，但分离时间将增加。固定相粒径dp：根据速率方程，粒径
13、减小，A项减小，C项减小，柱效增加。但粒径太小，不易填充均匀，A项又增大。,对色谱柱的填充提供理论指导,液膜厚度df：从柱效角度考虑，液膜越薄，柱效越高（根据速率方程），但允许的进样量减小。固定液与担体的配比一般在5:100-25:100之间，但现在更低配比的固定相也应用广泛。更重要的是：不同沸点的物质，应采用不同配比的固定相。,2.色谱分离基本方程,对于常规分析工作，一般选用：选择性系数（相对保留值）与保留指数I来评价固定液有效塔板数N有效来评价色谱柱与分离条件以分离度R作为柱的总分离效能指标,选择性系数,定义与相对保留值(ri,s)基本相同不同之处在于选择性系数是两个相邻峰的调整保留值之比
14、（后峰比前峰，1），相对保留值是被测物与标准物质的调整保留值之比（可小于1）它是评价固定液选择性的指标。选择性系数越大，该柱对此相邻峰的分离越好。,分离度R,R越大，说明两组分分离得越好。由于该定义综合了色谱动力学和热力学因素，可作为色谱柱的总分离效能指标。,色谱分离基本方程（Purnell方程）,色谱分离基本方程的意义,要改善物质对的分离（提高R），即提高两相邻物质的分离度，可以采取以下措施：提高柱效n提高选择性系数增大容量因子k,如何提高n,分离度R与理论塔板数N的平方根成正比关系，增加塔板数，有利于提高分离度。增加柱长可增加n，改善分离，但分析时间将大大延长，峰产生扩展。减小塔板高度H：
15、根据速率方程的启示制备一根性能优良的色谱柱是十分重要的。根据速率方程选择合适的色谱条件同样有效。,容量因子k的影响,分离度与容量因子有关，容量因子越大，分离越好。但当容量因子大于10，k/(k+1)的改变不大，而分析时间将大大延长。因此，k的最佳范围是1k10。,如何改变k,改变柱温，提高柱温可提高分离度改变相比，即改变固定相的量和改变柱死体积，死体积对k/(k+1)的影响很大，使用死体积大的柱子，分离度降低。在高效液相色谱中改变流动相的配比是最简便、最有效的方法,选择性因子的影响,如何改变a,改变柱温也可改变。选择合适的固定相种类选择合适的流动相的种类和配比,流动相种类和配比对k和a的影响,
16、选定合适的分离度,一般来说R应大于1.5。应用中应根据样品要求和定量方法确定。例如：含量50%的组分，要使峰高定量误差小于1%，需R1/2=1.28，而采用峰面积定量R1/2需1.00。含量1%的组分，要使峰高定量误差小于1%，需达到R1/2=1.83，而采用峰面积定量R1/2需2.37。,3.气相色谱操作条件的选择,流速柱温气化温度检测器温度,进样量载气种类固定相种类,流速u,根据速率方程，可计算求出最佳流速，此时柱效最高。在实际工作中，为缩短分析时间，往往使流速稍高于最佳流速。对于填充柱，氮气的实用最佳线速为10-15cm/s；氢气为15-25cm/s；氦气介于两者之间。若填充柱内径为4m
17、m，则体积流速为氮气30-40ml/min，氢气40-60ml/min。,柱温TC,每一种固定液都有它的最高使用温度，柱温不可超过这一温度，否则固定液挥发流失。柱温太高，组分挥发度靠拢，不利于分离。但柱温太低，被测组分的扩散速度下降，分配不能快速达到平衡，影响峰型，柱效下降，并使分析时间大大延长。原则：在保证难分离物质有良好分离的前提下尽可能采取较高柱温。,汽化温度,一般进样方法下，汽化温度比柱温高30-70。进样量大时温度略高一些，保证瞬间汽化。保证不可超过试样的分解温度。其它气化温度与具体进样方式有关。,检测器温度一般大于或等于柱温，具体与检测器种类有关。进样量液态试样一般进样量0.1-5
18、l。气态试样一般进样量为0.1-10ml。具体视柱类型，固定液含量（不能超过柱容量）、进样方式、检测器的灵敏度和线性范围等确定。,流动相（载气）种类,流动相的种类要视检测器种类确定。常用的有氢气（热导用）、氮气（氢火焰用）、氦气（均可用，但价格较高）。氢气和氦气适合于快速分析。氮气做载气峰型较好，柱效较高。,固定相种类,担体比表面大的多孔细小颗粒；化学惰性，热稳定性好；固定液相似相容原理高选择性、化学稳定、热稳定,三、色谱定性与定量方法,色谱定性分析以确定物质成分为目标；以保留值为基础，结合多种其他测试方法色谱定量分析以确定混合物中各组分含量为目标；以峰面积为基础,1.色谱定性分析,(1)利用
19、保留值及其规律定性各物质在一定的色谱条件下均有确定不变的保留值，因此保留值可作为定性指标。利用纯物对照定性利用文献值对照定性,纯物质对照定性,利用保留时间和保留体积定性,用相对保留值定性 用已知物增加峰高法定性,应用范围：适用于简单混合物，对该样品已有了解并具有纯物质的情况。优点：应用简便，不需要其他仪器。缺点：定性结果的可信度不高。提高可信度的方法：双柱、双体系定性,文献值对照定性分析,实现方法测定相对保留值ri,s测定保留指数I 优点：无需纯物质；保留指数具有较好的重现性和精密度；只与固定相和柱温有关。缺点：对结构复杂的物质，缺乏数据。适用范围：适用于简单混合物，无需纯物质。,(2)与其它
20、仪器或化学方法联合定性,离线联用方式化学法仪器法在线联用方式化学法仪器法,离线联用方式,收集方法：GC中一般采用液氮冷阱冷却后收集 应用范围：无标准物时，可对较为复杂的混合物进行定性分析缺点：麻烦,在线联用方式,用化学方法辅助定性柱前反应：在色谱柱前装上预处理柱，带有某些官能团的化合物在预柱中发生物理化学变化，其色谱峰会消失或移动，与反应前色谱图比较，可初步判断试样中含那些官能团。柱后反应：在色谱柱后装上T型毛细管分流器，将各组分导入官能团试剂反应管，利用官能团反应对组分进行定性。,与其它仪器联用定性混合物经色谱分离后，将各组分直接由接口导入其它仪器中进行定性。常用的联用方法有：GC-MS、G
21、C-FTIR、LC-MS其它仪器相当于色谱仪的检测器。使用范围：复杂样品的定性。优点：不需要标准物，定性结果可信度高，操作方便。缺点：需要特殊仪器或设备。,GC-MS,2 色谱定量分析,(1)色谱定量基础色谱定量分析是基于被测物质的量与峰面积成正比。在一定色谱条件下有：,（2）定量要解决的问题,峰面积的测量和计算校正因子的测量与计算色谱定量方法及其应用,峰面积的测量与计算,积分仪或色谱工作站简便、速度快，精度高，可达0.2-2%，对小峰及不对称峰的结果准确，是色谱发展趋势。手动测量与计算,峰高乘半峰宽法：适于对称峰峰高乘峰底宽度法：适于矮宽峰峰高乘平均峰宽法：适于不对称峰峰高乘保留值法：适于狭
22、窄峰，快速简便，常用于工厂控制分析。,重叠峰的测量,切线分峰垂线分峰,连线分峰计算机拟合分峰,校正因子的测量与计算,相对校正因子 由于绝对校正因子与仪器的灵敏度有关，又由于灵敏度与实验条件相关，且每一检测器的灵敏度都是不同的，它不容易测量准确，亦无通用性，所以实际工作中使用相对校正因子。,相对校正因子的表达式,质量校正因子 摩尔校正因子 相对响应值,被测组分的质量,标准物质量,分子量,相对校正因子的测量,理论上相对校正因子与试样、标准物质、检测器类型、载气类型有关，与其它色谱条件无关。无纯物质时或对结果准确度要求不高时，相对校正因子可通过查表得。即无纯物，手册上又无数据时，可用一些计算方法估算
23、这些物质的相对校正因子。,定量方法,校正归一化法 含归一化内标法 含内标标准曲线法外标法 含单点校正,校正归一化法,推导：,应用范围：当试样中各组分都能流出色谱柱，且在检测器上均有响应，各组分峰没有重叠时，可用此法。优点：简便、准确，当操作条件如进样量等变化时，对定量结果影响很小，该法适合于常量物质的定量。缺点：对该法的苛刻要求限制了它的使用。,归一化法,若各组分的定量校正因子相近或相同，则上式可简化为：,内标法,将一定量的纯物质作为内标物，加入到准确称量的试样中。,适用范围：当只需测定试样中某几个组分，且试样中所有组分不能全部出峰时可用。优点：受操作条件的影响较小，定量结果较准确，使用上不象
24、归一化法那样受到限制，此法适合于微量物质的分析。缺点：每次分析必须准确称量被测物和内标物，不适合于快速分析。,内标标准曲线法,fims/fsmi为常数K，此时wi%=K(Ai/As)，以wi%对Ai/As作标准曲线。优点：不必测校正因子，消除了某些操作条件的影响，方法简便，适合液体试样的常规分析。如白酒分析国标中采用此法。,外标法（标准曲线法）,用于常规分析优点：操作简单，计算方便。缺点：结果的准确度取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性。该法必须定量进样。,单点校正,当被测试样中各组分的浓度变化范围不大时而用单点校正法。即配制一个与被测组分含量十分接近的标准溶液，定量进样，计算被测物的含量。,定量中的误差问题,样品的代表性（样品的前处理）进样系统的影响柱系统的影响测量误差定量结果的误差分析,
