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1、甘薯蛋白抗癌作用研究进展,汇报内容,立题依据,我国甘薯（Ipomoea batatas）产量世界第一（约1亿吨/年），其中约50%用于生产淀粉、粉丝等初级产品，附加值低，加工过程中产生大量废液、废渣。废液中含1%左右可溶性蛋白，直接排放不仅 浪费资源，而且污染水质，亟待解决。甘薯块根中特有的贮藏蛋白Sporamin占其蛋白 总量的60-80%，本实验室前期研究表明，Sporamin能显著抑制人结肠癌HCT-8细胞在裸鼠腹腔内的弥散性生长，并抑制皮下接种的Lewis肺癌细胞在C57黑鼠体内自发性的肺转移。因此，本课题继续对sporamin的抗癌作用及其细胞内分子作用机制进行了探索。,研究内容,细
2、胞实验：观察甘薯蛋白对3种癌细胞（人结肠癌HT-29细胞、HepG2肝癌细胞、Bcap-37乳腺癌细胞）增殖及转移扩散能力的抑制作用，并探索其相应的细胞内信号转导机制。临床试验：观察甘薯蛋白（SPP）与5-氟尿嘧啶（5-FU）联用治疗人结肠癌的安全性及有效性。,本研究意义在于：探索甘薯蛋白在防治恶性肿瘤方面的作用和应用价值，为开发新型抗癌药物奠定基础。提高甘薯加工的利用率和产品附加值。有助于解决我国甘薯淀粉加工业废水污染环境的问题。,研究意义,技术路线,目的：观察甘薯蛋白对3种恶性肿瘤细胞增殖及侵袭转移能力的抑制作用，探索其细胞内分子作用机制。实验内容：MTT结晶紫染色荧光染色划痕愈合实验,抗
3、粘附实验明胶酶谱试验uPA分泌量测定(ELISA)免疫印迹RT-PCR,细胞培养：从中国科学院细胞库购买各种肿瘤细胞株，按照推荐的方法采用合适的培养基和培养条件在二氧化碳培养箱（37 C，5%CO2）中培养。条件培养液（CM）的制备：肿瘤细胞株在培养板中长满后，换成1%小牛血清的培养液并移入可调节氧气浓度的CO2培养箱中继续培养24 时，24小时后取出培养板，吸出上清液冻干后备用。MTT法细胞生长分析：将肿瘤细胞接种于96孔板（10，000 cells/well），加含10%胎牛血清的完全培养基培养24 h，然后将培养基换成含有或不含有各种处理试剂的RPMI 1640培养基。分别在换液后的1、
4、3、5天测定细胞增殖情况，采用MTT法，加入20 g vital染料MTT（1 mg/ml）后继续培养4 h，被细胞吸收的蓝色染料用DMSO（100 l/well）溶解，测定其在490nm处的吸光度。正式实验前先做预实验检查吸光度和细胞数量之间是否成正比。,试验方法,划痕愈合实验：将细胞按1-5 x 105个/孔的密度接种于12 孔培养板；形成单层细胞后，用20-200 微量pipette管尖端刮一个宽1 mm的划痕；用新鲜培养基洗两次，然后换成含不同浓度甘薯蛋白的培养基，37 孵育20 h后用PBS冲洗，4 多聚甲醛固定，在刮伤0 h和20 h后分别照相（放大100 倍），用ImageJ图像
5、软件计算刮口的平均距离。细胞愈合划痕的能力用它们的运动距离表示，计算方式如下：（0 h时划痕的平均距离-20 小时后划痕的平均距离/0 h时划痕的平均距离）100。抗粘附试验：将细胞接种到24孔板或6孔板，形成单层细胞后脱血清过夜培养，换含不同浓度甘薯蛋白和PMA的培养基处理24 h，然后用PBS冲洗2遍，加入200 或500 L 0.25%trypsin/0.1 mM EDTA，室温，100 RPM振荡消化细胞，记录细胞完全脱落需要的时间.酶谱法测定MMPs和uPA的活性：分别用明胶酶谱和纤溶酶原-酪蛋白酶谱法测定条件培养基中分泌的MMPs和uPA的活性，用含或不含100ng/ml PMA及
6、不同浓度甘薯蛋白的培养基处理细胞4 h，收集培养基，过滤除去悬浮细胞，用浓缩离心管浓缩25-50倍，各组取等量培养基与不含SDS和-mercaptoethanol的样品缓冲液混合后上样，用含2 mg/ml 明胶的10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳结束后将凝胶置于复性缓冲液液（2.5%Triton-X100）中震荡洗脱30 min4次；明胶孵育液（50 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L CaCl2、200 mmol/L NaCl、1 mol/L ZnCl2）37 孵育24 h，考马斯亮蓝染液染色2 h，脱色3040 min。分析凝胶图像，应用ImageJ软件读取条带面积和酶解
7、条带灰度，酶含量=条带面积（条带灰度背景灰度），以样本酶含量/对照样品酶含量比值表示样本的酶活性值。uPA酶谱做法与MMPs相似，只不过用1 mg/ml酪蛋白(MP Biomedicals,Inc.,Irvine,CA)和1 U/ml纤溶酶原(MP Biomedicals,Inc.)代替了明胶。,试验方法,条件培养基中uPA分泌量的测定：采用ELISA法，根据试剂盒(Cusabio Biotech,China)说明书进行测量。免疫印迹（Western Blotting）：用Western blot法确认各种细胞因子和信号转导分子的表达和激活情况。将处理后的细胞用裂解液（150 mM NaCl,
8、1 mM EDTA,40 mM Tris-HCl,pH 7.6,1%NP-40,0.1 mM PMSF,10 g/ml leupeptin,1 g/ml pepstatin,10 g/ml aprotinin）裂解，BCA法测蛋白含量，样品经SDS-PAGE电泳分离，转移到PVDF膜上。用含2%t脱脂奶粉的TBS缓冲液（pH 7.6）浸泡，4过夜封闭非特异性的连接位点。然后加入各种一抗振荡孵育2 h，然后在相应的二抗中反应 1 h，清洗干净后将反应后的条带成像。,试验方法,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术半定量分析mRNA表达水平:使用trizol提取细胞中总RNA，A260/280测吸
9、光度测量浓度并评估RNA样品的纯度和完整性，将2微克总RNA反转录成cDNA，然后扩增cDNA，0.5-2.0%琼脂糖凝胶电泳分离细胞DNA，紫外透射仪上观察拍照。引物序列如下：huMan uPA：5 primer(5-GGGGGCTCTGTCAC-CTACG-3)and 3 primer(5-GGCCCCAGCTCACAATTCCAGTC-3);VEGF 5 primer(5-GGAGGA GGGCAGAATCATCACGAA-3)and 3primer(5-GCCTTGCAACGCGAGTCTGT-3);glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GA
10、PDH),forward:5-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3,reverse:5-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3.MMP 9：sense 5-CAT CGT CAT CCA GTT TGG TG-3 antisense 5-GGT GTA GAG TCT CTC GCT GG-3MMP-2：上游为：5-TCAGTGCTGGCTGCC1TrAGA-3，下游为5-ATGTGG GCT GAG ATG CAC TG-3,试验方法,荧光显微镜观察细胞凋亡（Hoechst 33258 核染色）：将细胞接种到24孔板 上(1.2x105/孔)，托血清16-24 h后用不同浓度SP
11、P处理细胞48 h，吸去培养基，用PBS洗细胞3 次。然后用2.5%的戊二醛固定细胞4 h，置摇床上用0.9%NaCL洗细胞3次。除去上清液后，用1g/ml Hoechst 33258溶液在冰上避光处理细胞30min，然后用0.9%NaCL漂洗3次，甘油封闭后立即于荧光显微镜下(Olymus IX71)紫外光(360 nm)激发，观察细胞核染色情况。,试验方法,结果,结果,结果,结果,Fig 1.Sporamin inhibited the wound closure of HT-29 cells in the presence of PMA.*,P0.05 vs.PMA alone;#,P0
12、.05 vs.vehicle,划痕愈合实验,Fig 3.Sporamin suppressed the PMA-induced secretion of uPA in HT-29 cells after 16 h,Fig 2.Sporamin decreases adhesion of colorectal carcinoma HT-29 cells to the substrate in the presence of PMA in HT-29 cells after 16 h,Fig 4.Gelatin zymogram of conditioned medium from HT-29 c
13、ancer cells treated with 100 ng/ml PMA and various concentrations of sporamin during 4-h incubation period showing direct inhibitory effect of sporamin on MMP-9 and MMP-2 activity.,Fig 5.uPA,MMP-9 and MMP-2 gene expression is down-regulated in human colorectal cancers.,Fig 6.Sporamin inhibited PMA-i
14、nduced Akt phosphorylation time-dependently in HT-29 cells,Fig 7.Hoechst 33258 nuclear staining,Fig 8.RT-PCR,uPA,Ctr PMA 1 10 50 uM,Ctr PMA 1 10 50 uM,Ctr PMA 1 10 50 uM,GAPDH,Ctr PMA 1 10 50 uM,VEGF VEGF,Figure 8.Schematic presentation of sporamin-inhibited signaling pathway leading to suppression
15、of colon cancer cell migration and invasion.,Figure 7.EGFR signaling pathway.Once theEFGR tyrosine residues are phosphorylated,PI3K is translocated to the cell membrane and binds to tyrosine phosphate which triggers the PI3K catalytic subunit p110 to produce PIP.PI3K then promotesAKT activation.p-AK
16、T then activates various targets that result in cell growth,proliferation,and survival.,小结,甘薯蛋白冲剂的制备:甘薯粗蛋白粉+辅料用适量乙醇润湿搅拌制粒复合膜袋包装杀菌备用,甘薯蛋白冲剂辅助治疗结肠癌的临床试验,蛋白含量：6 克/袋,实验对象入选/排除标准：将10名按TNM分期法属于II期（UICC：T3-T4,N0,M0），刚接受完切除手术，无残留肿瘤组织，无其它严重并发症或恶性疾病，造血功能、肝肾功能正常，尚未开始化疗、放疗或免疫治疗的结肠癌患者。试验分组和剂量：在获得患者签署的书面知情同意书后将其随
17、机配到实验组和对照组，每组5人。实验组采用5-FU加sporamin蛋白冲剂联合治疗，对照组采用安慰剂加5-FU治疗。两组5-FU的剂量均为450 mg/m2静脉滴注，甘薯蛋白冲剂的剂量为12g/d（1日2次，1次6g）口服。,监测指标：在实验开始前、后分别检查、测定以下项目：症状体征（直肠指检、纤维结肠镜、下腹及腰骶部持续疼痛、肛门失禁、腹水等）；血液指标（全血细胞计数、肝功、肾功、血糖、血脂、CEA、trefoil factor 3、growth/differentiation factor 15、溶血磷脂、胰岛素、CA15-3、CA 19-9、CA242、p53 Ab、和细胞角蛋白cyt
18、okeratins）；粪便指标（粘液便、血便、隐血、直肠粘液T抗原检测）的变化情况；转移情况指标：肝、肺、骨等主要脏器转移情况；安全性指标：肝功、肾功、不良反应记录等。自我（主观）感觉指标：患者自我感觉。,结果,两组间无显著性差异,两组间无显著性差异,两组间无显著性差异,*P0.05,CA19-9，糖链抗原19-9；NSE，神经元特异性烯醇化酶；CEA，癌胚抗原；CA242，糖链抗原242；Ferritin，铁蛋白；HCG，人绒毛膜促性腺激素；AFP，甲胎蛋白；Free-PSA，游离前列腺特异性抗原；PSA，前列腺特异性抗原，CA125，癌抗原125；HGH，生长激素；CA15-3，癌抗原15
19、-3.,*P0.05,CA19-9，糖链抗原19-9；NSE，神经元特异性烯醇化酶；CEA，癌胚抗原；CA242，糖链抗原242；Ferritin，铁蛋白；HCG，人绒毛膜促性腺激素；AFP，甲胎蛋白；Free-PSA，游离前列腺特异性抗原；PSA，前列腺特异性抗原，CA125，癌抗原125；HGH，生长激素；CA15-3，癌抗原15-3.,A,B,C,*,*,D,*P0.05,实验组Ferritin和CEA的下降幅度大于对照组,*,*P0.05,治疗前后肝、肾功能、尿常规、便常规变化情况,两组患者肝、肾功能均改善，组间无显著差异。两组患者尿糖、尿蛋白、RBC，WBC情况均改善，组间无显著差异；两组患者粪便潜血及镜检均改善，组间无显著差异。,小结,口服甘薯蛋白是安全的，无不良反应。口服甘薯蛋白冲剂可降低患者铁蛋白、癌胚抗原，及糖类抗原242水平，其抗癌作用值得进一步研究。,汇报结束,欢迎批评指正！,
