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1、细胞因子趋 化 因 子 及 其 受 体 家 族 研 究 进 展,细胞因子(Cytokine,CK)细胞因子是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质的统称。细胞因子介导多种免疫细胞间的相互作用有多种其他名称：单核因子、淋巴因子、集落刺激因子等,在免疫系统中，各种免疫细胞均能合成和分泌小分子的多肽类因子,它们调节机体的免疫调节功能,参与免疫细胞的增殖、分化等功能,这些因子统称为细胞因子。细胞因子除存在于免疫系统外，在机体的各个系统也广泛存在,发挥极为重要的生理调节作用。与免疫有关的细胞因子主要包括淋巴细胞产生的淋巴因子、单核巨噬细胞产生的单核因子、白细胞介素(interleukin,IL)、干扰
2、素(interferon,IFN)、集落刺激因子(colony stimulating factor,CSF)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、趋化因子(chemokine)、转化生长因子（transforming growth factor,TGF）等,它们在免疫系统中起着非常重要的调控作用,在异常情况下也会导致免疫病理反应。,细胞因子的共同特性,是低分子量（1530kD）的蛋白或糖蛋白；天然的细胞因子由抗原、丝裂原或其他刺激物活化的细胞分泌，且多以单体形式存在，以非特异性方式发挥作用，以较高的亲和力与其受体结合；细胞因子的分泌是一个短时自限过程，可以旁分
3、泌、自分泌或内分泌的方式发挥作用,一种细胞可产生多种细胞因子，不同类型的细胞也可产生一种或几种相同的细胞因子；一种细胞因子可对多种靶细胞发挥作用，产生多种不同的生物学效应，称多效性；几种不同的细胞因子也可同一种靶细胞发生作用，产生相同或相似的生物学效应，称重叠性；一种细胞因子可以抑制另一种细胞因子的某些生物学作用，表现为拮抗效应；也可以增强另一细胞因子的某些生物学作用表现为协同效应。,细胞因子的功能分类,白细胞介素(interleukin,IL)干扰素(Interferon,IFN)集落刺激因子(colony stimulating factor,CSF)肿瘤坏死因子(Tumor necros
4、is factor,TNF)生长因子(Growth factor,GF)趋化因子(chemokine CK),（一）白细胞介素(Interleukin,IL),1 产生细胞：淋巴细胞、单核吞噬细胞等 2 作用 介导白细胞间相互作用、调节细胞的生长分化、参与免疫应答和介导炎症反应。3 种类：IL-1-IL-30,IL-1 发热,促进T、B细胞增殖分化 IL-2 T细胞生长因子，增强NK细胞和LAK细胞的杀伤活性IL-3 刺激骨髓多能干细胞的增殖分化IL-4：促进B细胞增殖分化，诱导B细胞发生Ig类 别转换，产生IgE或IgG类抗体 抑制Th1细胞IL-5:促进B细胞增殖分化，诱导B细胞发生Ig类
5、 别转换，产生IgA类抗体 刺激T细胞增殖分化IL-6：促进T、B细胞增殖分化IL-7：诱导胸腺细胞分化、前T和前B增殖IL-10：抑制性细胞因子，抑制TH1细胞合成分 泌细胞因子IL-13:抑制单核巨噬细胞合成分泌炎性细胞 因子（IL-1、6、8和TNF-）,（二）干扰素（Interferon,IFN）,抵抗病毒的感染,干扰病毒复制的细胞因子，包括 IFN、I型干扰素 IFN和 来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织 细胞等 功能：抗病毒感染、抗肿瘤生长 免疫调节(较弱）应用：病毒感染性疾病等，肝炎、SARS,II型干扰素,干扰素（IFN)来源：活化的T细胞和NK细胞产生功能：免疫调节 提
6、高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性 抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答 趋化作用 抗病毒和抗肿瘤作用（次要）,（三）肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)：可以直接诱导肿瘤细胞凋亡的细胞因子。分类：TNF：活化的单核巨噬细胞产生 亦称恶液质素TNF：活化的T细胞产生，亦称淋巴毒素。两种TNF的分子量为51kD，结构为同源三聚体，具有相同的结合受体和生物学活性,TNF的生物学活性,1 杀瘤、抑瘤作用（1）直接杀伤或抑制肿瘤细胞（2）激活NK细胞和巨噬细胞，间接发挥作用（3）损伤血管内皮细胞，促进血栓的形成，阻断肿瘤组织的血流供
7、应，导致肿瘤出血坏死 2 免疫调节作用（1）刺激靶细胞合成分泌细胞因子，如IL-1、IL-6、IL-8等（2）增强T、B细胞对抗原和有丝分裂原的增殖反应（3）增强Tc细胞对靶细胞的杀伤活性,3 促进炎症反应（1）诱导血管内皮细胞表达细胞间粘附分子1（ICAM-1)（2）分泌IL-1、IL-8等炎症分子和趋化因子（3）增强中性粒细胞和单核吞噬细胞的吞噬功能4 抗病毒作用（1）类似于IFN的作用（2）直接杀伤病毒感染细胞,5 致热作用 内热性热源质(1)直接作用于下丘脑体温调节中枢（2）刺激巨噬细胞释放IL-16 引发恶液质 由TNF引起，能够促进蛋白脂肪消耗、分解，引起代谢紊乱 表现为厌食、恶心
8、、消瘦、衰弱和贫血,分类粒细胞集落刺激因子（granulocyte-CSF,G-CSF)巨噬细胞集落刺激因子（macrophage-CSF，MCSF)粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-maceophage-CSF,GM-CSF)红细胞生成素（erythropoietin,EPO)干细胞生成因子（stem cell factor,SCF)多能集落刺激因子（multi-CSF),（四）集落刺激因子(Colony stimulating factor,CSF):,集落刺激因子的作用,(五）生长因子(Growth factor)具有促进不同类型细胞生长效应的细胞因子分类：转化生长因子
9、（transforming growth factor-,TGF)表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF)血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF)成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,FGF)神经生长因子(nerve growth factor,NGF)血小板衍生的生长因子（platelet derived growth factor,PDGF)肝细胞生长因子（hepatic growth factor,HGF),生物学活性：（1）对造血干细胞、上皮细胞、血管内皮细胞、T细胞
10、和B细胞具有生长抑制作用，但对肿瘤细胞的生长无抑制作用（2）抑制IL-2诱导的T、B细胞活化。（3）抑制巨噬细胞、NK细胞、LAK细胞和Tc细胞的杀伤活性,转化生长因子（TGF）为同源二聚体，MW25kD产生细胞：正常细胞和肿瘤细胞,4）促进间质细胞增殖，对成纤维细胞、成骨细胞和平滑肌细胞等促分裂作用（5）对单核细胞和成纤维细胞具有趋化作用，促进伤口愈合。（6）促进细胞外基质如 胶原蛋白和纤粘连蛋白的生成，在细胞形态维持和增殖、分化过程中起重要作用，有利于胚胎发育和细胞修复,(六）趋化因子(Chemokine):一组具有趋化作用的细胞因子,能吸引免疫细胞到免疫应答局部,参与免疫调节和免疫病理反
11、应。,趋化因子是在多种刺激物如生长因子、干扰素、细菌产物、病毒感染等因素的刺激下，成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞等分泌的一类小分子物质，它们大多具有促细胞分裂和趋化活性，可诱导多种免疫细胞到炎症部位，因此，趋化因子在机体的防御和炎症反应等方面起着重要的调节作用。新近研究表明，趋化因子在多种肿瘤的生长、转移过程中发挥重要作用。目前，发现近50种趋化因子，成为最大的细胞因子亚家族。,肿瘤细胞趋化因子表达谱差异的生物学意义 越来越多的研究证实多数肿瘤可分泌多种异常高水平的趋化因子。根据趋化因子表达谱的差异，决定了肿瘤浸润白细胞的种类与浸润程度。某些肿瘤可利用与宿主的特异性趋化因子受体结合机制得以筛选
12、进而获得生长优势。并与一些表型如：激素/生长因子不依赖性靶器官特异性（肝，肺，骨，淋巴）转移机制有关，如通过排泌IL-8和GCP-2等趋化因子可募集嗜中性白细胞并上调蛋白酶活性，从而降解细胞外基质，促进肿瘤细胞的侵袭转移等。,肿瘤细胞自身可合成多种生物活性物质，如异位激素、生长因子及多种趋化因子，并不受宿主调控，其细胞因子信号传导通路异常的机制尚不清楚!虽然证实肿瘤细胞所分泌的趋化因子在氨基酸组成和蛋白结构上与正常细胞的产物完全相同，但可以确定是与正常机体组织反应所诱导的机制不同。肿瘤细胞趋化因子分泌的时相调控机制与相关信号通路有待进一步阐明，肿瘤源性趋化因子转录后水平的蛋白质修饰、糖基化差异
13、有可能是导致异常生物学活性与作用途径的机制。,趋化因子概念：趋化因子（chemokines,chemoattractant cytokines，CK）是一组能使细胞发生趋化运动的小分子细胞因子。趋化运动是指细胞向高浓度刺激物方向的定向运动。它们多为小于100个氨基酸的小分子多肽.,1999年，国际命名委员会根据CK的结构特征命名。绝大多数CK有4个保守的半胱氨酸（Cys），根据前两个Cys的相对位置不同可主要分为4个趋化因子亚家族:CXC（）、CC（）、C（）和CX3C（）趋化因子。分别用CXCLn、CCLn、XCLn和CX3CLn代表CXC、CC、C 和CX3C家族的不同成员，L为Ligan
14、d，迄今发现的CK有CXCL1-16，CCL1-28，XCL1-2和CX3CL1。CK受体的命名规则与此相似，用R即Receptor代替L。目前发现的CK受体有CCR1-11，CXCR1-6，XCR1和CX3CR1。,CC趋化因子的名称、染色体定位及受体,趋化因子的结构、定位及组成,1、来自同一个祖先基因,CKs分子量小，在8-12KD之间；2、蛋白质一级结构上具有同源性，不同成员在氨基酸水平上有2190的同源性，CXC与CC 成员之间：20%-30%；同一亚族不同成员间同源性为2590；,趋化因子的共同结构特点,4、CKs有2个螺旋，3个折叠；,3、多数CKs含有4个保守的Cys的保守基序(
15、motif)，组成特征性的两个二硫键；第一个Cys前的N端肽段较短，约412氨基酸，第4个Cys后C端肽段较长，为1824氨基酸；,CXCL12/SDF-1的空间构型图（NMR）,5、不同CKs具有相似的空间结构；,6、其相应的受体属于G蛋白偶联受体，这类受体有7个跨膜区(seven predicated transmembrane domains,STR)，在胞浆内与三个亚单位所组成的G-蛋白(heterotrimeric G protein)相偶联。,二、趋化因子受体,趋化因子受体属于7次跨膜的G蛋白偶联受体超家族（GPCRs，G-protein coupled receptors）,1、
16、7次跨膜，C端位于胞内，有Ser/Thr位点，参与信号转导,(一)趋化因子受体的特点,2、不同CKR之间具有同源性；,3、胞内区与G蛋白偶联，G蛋白由组成；4、亚单位具有GTP结合位点和GTP酶活性；5、CKR未与CK结合时，呈聚合状态，与GDP结合；与CK结合后，与GTP结合，游离，活化下游效应物.,6、与CKR偶联的G蛋白有多种，与趋化运动有关的 G蛋白亚单位多为PTX敏感的GI。,（二）、趋化因子受体的分类1、根据结合配体的不同，分为CXCR，CCR，XCR,CX3CR。2、根据特异性不同，分为特异性受体、共享性受体、杂合性受体（DARC，Duffy血型抗原，红细胞趋化因子受体）、孤儿受
17、体、病毒受体等。,趋化因子的基本功能,趋化因子与受体结合后，数秒钟内即可观察到细胞形态的改变。细胞骨架结构发生改变，伸出许多伪足，便于细胞游走；趋化因子的作用导致整合素表达上调，细胞活化，白细胞在进入组织前粘附到血管内皮细胞。胞内钙离子水平升高，超氧化物和生物活性脂的产生，胞浆颗粒的释放，如嗜中性粒细胞、单核细胞释放蛋白酶；嗜碱性粒细胞释放组织胺；嗜酸性粒细胞释放细胞毒性蛋白等。中性粒细胞在机体发挥着重要的防御功能，包括IL-8/CXCL8、ENA-78/CXCL5在内的多数CXC家族趋化因子不但能趋化中性粒细胞，而且能活化中性粒细胞。单核吞噬细胞在多细胞生物体内发挥防御功能，CC家族趋化因子
18、所有成员和CX3C趋化因子均能趋化单核吞噬细胞，其广泛的作用是保证机体在防御病毒细菌等病原生物感染及清除组织损伤产物时，有足够的单核吞噬细胞集中到反应部位，维持机体的稳定。,1.对粒细胞和单核吞噬细胞的作用（一）趋化作用（二）上调整合素的表达,活化白细胞（三）促进细胞脱颗粒和生物活性物质释放 CCL2/MCP-1：嗜碱性粒细胞释放组织胺；CXCL8/IL-8：嗜中性粒细胞产生活性物质，呼吸爆发,增强细胞粘附和杀伤病原体的能力等（四）调节血管生成 ELRCXC、CCL2促进血管生成；CXCL10、CCL21/SLC抑制血管生成。（五）生长因子活性，促进细胞增殖,趋化因子在免疫细胞发育、定位及免疫
19、应答中的作用,（一）CKs促进免疫细胞发育、成熟：1、CXCL12/SDF-1和CXCR4促进B细胞分化发育成熟 胚胎期，B淋巴细胞在肝脏中发育，出生后迁移到骨髓。CXC趋化因子SDF-1/CXCL12在胎肝和骨髓中高表达，其受体CXCR4在造血祖细胞及B淋巴细胞前体细胞中高表达。CXCR4或SDF-1基因敲除小鼠的B淋巴细胞发育严重受损，骨髓的髓系造血功能几乎完全缺陷，并有心脏发育异常。给CXCR4基因敲除小鼠输入正常功能和数量的B淋巴细胞前体细胞，不能弥补由CXCR4基因缺陷所造成的异常，因此，SDF-1/CXCL12和CXCR4在B淋巴细胞发育中作用是不可替代的。B淋巴细胞在骨髓内发育成
20、熟后，未接受外来抗原的刺激，为天然B淋巴细胞(nave B sells)。天然B淋巴细胞高表达CXCR4和CCR7，在SDF-1/CXCL12、SLC/CCL21、ELC/CCL19及其他分子作用下，穿过高内皮微静脉，定位于淋巴结的滤泡状B淋巴细胞区。,CXCL12/SDF-1和CXCR4促进B细胞分化发育成熟,HPC表达CXCR4，骨髓基质细胞产生CXCL12/SDF-1；CXCL12/SDF-1趋化HPC与基质细胞相互作用，促进HPC向B细胞发育，表达sIg；成熟B细胞对CXCL12/SDF-1反应性，离开骨髓，进入血循环,2、CCL25/TECK和CCR9、CXCL12/SDF-1和CX
21、CR4 CCL22/MDC、和CCR4等促进T细胞发育成熟 可能因为TECK/CCL25在早期胸腺的发育中起更为重要的作用。在从CD4+CD8+双阳性T淋巴细胞向CD4+/CD8+单阳性T淋巴细胞的分化过程中，MDC/CCL22、SLC/CCL21、ELC/CCL19发挥重要作用。这些趋化因子能趋化单阳性T淋巴细胞，而对双阳T淋巴细胞不发生反应。淋巴细胞在胸腺内经过阳性选择和阴性选择后，发育成熟。天然T淋巴细胞高表达CXCR4和CCR7，在SDF-1/CXCL12 SLC/CCL21、ELC/CCL19和其他分子的作用下，穿过高内皮静脉，定位于淋巴结的T淋巴细胞区，与树突状细胞相互作用，产生免
22、疫应答，天然T淋巴细胞活化。,CCL25/TECK和CCR9、CXCL12/SDF-1和CXCR4、CCL22/MDC和CCR4等促进T细胞发育成熟,3、CCL3，4/MIP-1、和CCR1，CCR2，CCR5等促进非成熟DC 向炎症部位聚集，摄取抗原，发生功能成熟。树突状细胞分泌的IL-12通过CD40促使活化T淋巴细胞向Th1细胞极化，天然T淋巴细胞分泌的IL-4在树突细胞分泌的IL-6的作用下促使活化T淋巴细胞向Th2细胞极化。有些组织产生高水平的TGF-，抑制活化T淋巴细胞向Th2细胞极化，使活化的T淋巴细胞维持在半天然状态（a semi-nave state,Tsn）。极化的T淋巴细
23、胞表达不同的趋化因子受体，Th1细胞高表达CXCR3、CCR1、CCR2和CCR5；Th2细胞高表达CCR3、CCR4和CCR2，他们分别在不同的免疫应答过程中发挥作用。,(二）CCL21/SLC，CCL19/ELC和CCR7、CXCL13/BCA-1/BLC和CXCR5 协助T、B、DC细胞在周围免疫器官中正确定位并相互作用 在机体抵御外来异物入侵的过程中，需要天然免疫应答和适应性免疫应答共同合作。趋化因子对于免疫细胞向感染部位的聚集是必不可少的。天然免疫刺激巨噬细胞和树突状细胞，导致多种趋化因子的产生，调控树突状细胞表面趋化因子受体的表达。这些趋化因子和趋化因子受体表达水平的改变，彼此相互
24、协调，使得负载抗原的树突状细胞从局部组织进入淋巴组织，活化天然T淋巴细胞和B淋巴细胞，启动适应性免疫应答。TLRs(Toll-like receptors)活化后，后续产生的趋化因子引导活化的T淋巴细胞回到外来抗原进入、启动天然免疫应答的组织中。,（三）促进效应T细胞回到炎症和感染部位 在再次免疫应答中，抗原特异性应答产生的趋化因子使天然免疫细胞进入炎症部位，通过天然免疫效应细胞进一步促进适应性免疫应答。,1、TFH：CXCR5，进入滤泡区，辅助B细胞产生抗体 的类别转换；2、Th1:CCR5,CXCR3，进入病毒感染等炎症部位；3、Th2:CCR3,4,8,CXCR4，进入过敏反应部位。,趋
25、化因子的常用研究方法,（一）趋化实验：1、体内实验：皮下、腹腔、静脉注射，观察细胞 浸润情况；繁琐。2、体外实验：最常用的方法是Boyden小室法，也称微孔滤膜 法。48孔趋化小室，上层放靶细胞，下层放待检测因子，两 层之间有聚炭膜隔开；简单易行。细胞类型 膜孔径 趋化时间 Neu:3um 30min；Lymphocytes:5um 120min；Mo:8um 90min,反应结束后，洗掉非特异结合细胞，固定、染色，记数。记数方法：高倍镜下每孔随机选5个视野，取平均值。趋化活性表示方法：通常以趋化指数（chemotatic index,CI）表示。CI指实验组细胞数与对照组细胞数（三个复孔 的平均值）的比值，CI大于2有意义。,Boyden小室示意图,Aurora-A高表达增加了肿瘤细胞的体外迁移能力,（二）钙流实验,多数CK与受体结合后,胞内Ca2+；Indo-1 AM或Fura-2 AM等是Ca2+螯合剂EGTA的衍生物，可特异高亲和Ca2+；将靶细胞与荧光探针孵育；检测荧光强度变化，反映CK活性。,（三）功能实验,CXC CKs:弹性蛋白酶、葡萄糖醛酸酶释放检测、呼吸 爆发实验；MIP-1，：用骨髓造血干细胞集落形成实验；CC CKs:组织胺释放。,
