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1、实验四血清-球蛋白的提纯,【实验目的】,1.掌握盐析、凝胶层析、透析法分离纯化蛋白质的基本原理及操作；2.掌握离心机的操作；3.熟悉蛋白质定性检测的方法；,实 验 原 理,【实验原理】,（一）盐 析 法,定义：加入大量中性盐以破坏蛋白质的稳定因素并 使从溶液中沉淀析出的现象。原理:破坏蛋白质两个稳定因素：水化膜和电荷层中性盐：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。优点：蛋白质不变性，常用。,（二）透 析 法,定义：利用半透膜把大小分子分开的方法。,材料：特制的半透膜，截止分子量一般为一万。,临床应用：血液透析,（三）层析法,待分离物质随(流动相)经过一个固态物质(固定相)时，根据溶液中
2、待分离物质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离蛋白组分在两相中反复分配，并以不同流速流经固定相实现分离。,凝胶层析法,（四）离心技术,离心技术 是将含有微小颗粒的悬浮液置于离心转子中，利用转子绕轴旋转产生的离心力将微小颗粒按密度或质量的差异将其分离的方法。,沉降速度(v)指在强大的离心力作用下，单位时间内物质颗粒沿半径方向运动的距离。v=6.09210-4D2（m）n2r/m,D 颗粒直径 颗粒的密度m 介质的密度m 介质粘度 r 旋转半径（物质质点所处位置与旋转中心的距离）N 转子转速,人血清中几种主要蛋白组分,【离心操作要领】1、根据待离心的溶液性质及体积选择合适的离心管。装载液体时要按
3、各种离心机操作说明进行。无盖离心管不能装的太满。密封的或有盖离心管常要求装满，以免离心管变形。2、精确地平衡离心管及其内容物。3、平衡后的离心管和内容物（包括套筒）应对称放置4、启动离心时离心速度由慢到快，当到达离心时间时，开启减速或速度调节旋钮减速。,（五）检测蛋白质、NH4+的方法,检测蛋白质 双二缩脲试剂：溶液显紫红色 20磺柳酸：有白色沉淀产生检测NH4+纳氏试剂：黄色或棕色,【实验步骤】,1.盐 析 透 析 脱 盐4.检 测,1.盐析,取离心管一支加入血清2ml,加入2ml PBS摇匀,逐滴加入pH7.2饱和(NH4)2SO4 2ml,摇匀,静止10分钟，再离心（2000转/分）10
4、分钟,上清液（主要含清蛋白）倾入试管中,沉淀用1ml PBS搅拌溶解,逐滴加饱和(NH4)2SO4 0.5ml,摇匀,静止10分钟，再离心（2000转/分）10分钟,倾弃上清液（主要含、球蛋白）,沉淀即为初步纯化的球蛋白,脱 盐,透析,2.透 析,清蛋白,换 水,透析袋未放入水中时,立即取水中液体检查有无NH4；放入水中后，每隔4分钟检查一次，共3次，比较NH4透出的情况。,约0.5小时，检查袋外液体的NH4；取袋外液2滴，置于小试管中，然后滴加20磺柳酸12滴，观察有无沉淀产生。,3.脱盐,上样球蛋白，PBS 10滴溶解,加入洗脱剂PBS 1020ml,装柱 葡聚糖凝胶G25，柱 高1/22
5、/3柱长，玻璃柱标识的200处。,流速：每分钟10滴左右,收集20滴换一支试管,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,每组两块比色板,洗净备用。一块在各孔滴加纳氏试剂（检测NH4+）,另一块滴加双二缩脲试剂（检测蛋白质）。若发现有显色反应此孔显色剂弃用。不用滴管,避免污染,直接用试管倒用“-”表示无现象，用“+”,“+”,“+”等表示颜色深浅,回收凝胶,.层析后洗脱液检测,【实验结果】,表1.层析后洗脱液的显色结果,表2.透析后的袋外溶液显色结果,【注意事项】,.使用离心机的操作注意事项。.装柱时检查旋钮是否旋紧，是否漏水。.装柱后凝胶均一无断层，无气泡，柱床面平整。柱床面保持有缓冲液。.层析加样时动作缓慢轻柔，不要破坏柱床面的平整。.层析时，先用专用移液管将PBS移到小烧杯中，然后再用巴氏滴管在层析柱上端加缓冲溶液。.每用一次滴管，请用水清洗干净，防止试剂及被测样品交叉污染,金式法测定血清谷丙转氨酶酶活性,下次预习要点,
