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1、1,2.3 吸光光度法的灵敏度与准确度,2.3.1 灵敏度的表示方法,摩尔吸光系数()A=b c=A/bc(Lmol-1cm-1),越大,灵敏度越高:105为高灵敏度.,2,2.Sandell(桑德尔)灵敏度(S)定义：截面积为1cm2的液层在一定波长或波段处，测得吸光度为0.001时所含物质的量。用S表示，单位：gcm-2A=bc=0.001 bc 0.001/,S小灵敏度高;相同的物质,M小则灵敏度高.,3,例1 邻二氮菲光度法测铁(Fe)=1.0mg/L,b=2cm,A=0.38 计算、S 和,解：c(Fe)=1.0 mg/L=1.010-3/55.85=1.810-5(molL-1),
2、S=M/=55.85/1.1104=0.0051(g/cm2),或,4,c=1.0mg/L=1.010-3 g/1000mL=1.010-4 g/100mL,5,例2 比较用以下两种方法测Fe的灵敏度.,B.用4,7-二苯基邻二氮菲光度法测定铁5332.2104 Lmol-1cm-1S=55.85/(2.2104)0.0025(gcm-2),B方法比A方法的灵敏度高.,A.用邻二氮菲光度法测定铁时，5081.1104 Lmol-1cm-1S=55.85/(1.1104)0.0051(gcm-2),6,2.3.2 准确度仪器测量误差,由于T 与浓度c 不是线性关系，故不同浓度时的仪器读数误差T
3、引起的测量误差 c/c不同。,7,测量误差公式推导:,dA=d(-lgT)=d(-0.434lnT)=-0.434dT/T,A=-lgT,T lgT 最大时，即(TlgT)=0 时误差最小,算得 lgT=-0.434,T=36.8%,A=0.434,8,浓度测量的相对误差与T(或A)的关系,实际工作中，应控制T在1070,A在0.151.0之间(调c,b,),9,2.4.1 显色剂与显色反应 显色反应：在光度分析中将试样中的待测组分转变成有色化合物的反应叫显色反应。,8.4 显色反应与分析条件的选择,10,显色反应一般分为两大类：一类是配位反应；另一类是氧化还原反应。Fe3SCN=FeSCN；
4、Mn25e4H2O=MnO48H 在这两类反应中，用得较多的是配位反应。显色剂：与待测组分生成有色化合物的试剂叫显色剂；1无机显色剂：2有机显色剂：1）优点：a具有鲜明的颜色，都很大（一般可达到104以上），所以测定的灵敏度很高；b生成的一般为螯合物，稳定性很好，一般离解常数都很小；c选择性好 d有些有色配合物易溶于有机溶剂，可进行萃取光度分析，提高了测定的灵敏度和选择性。,11,有机显色剂,OO型：,ON型：,PAR,S型：,双硫腙测定很多重金属离子，如：铅、锌、铜、银、汞、镉等。,NN型：,丁二酮肟,邻二氮菲,磺基水杨酸,12,显色反应的选择,灵敏度高，一般10 4;选择性好;显色剂在测定
5、波长处无明显吸收,对照性好,max 60 nm;反应生成的有色化合物组成恒定，稳定;显色条件易于控制，重现性好.,13,2.4.2 显色条件的确定,c(R),c(R),c(R),1.显色剂用量（c(M)、pH一定）,Mo(SCN)32+浅红Mo(SCN)5 橙红Mo(SCN)6-浅红,Fe(SCN)n3-n,14,2.显色反应酸度（c(M)、c(R)一定）,pH1pHpH2,pH,15,3.显色温度及显色时间(c(M)、c(R)、pH一定),另外，还有介质条件、有机溶剂、表面活性剂等.,16,2.4.3 测定中的干扰以及消除方法,1.化学法,17,测Co2:(生成络合物性质不同),消除干扰，也
6、可采取分离法。,18,2.物理法选择适当的测定波长,19,1.仅络合物有吸收，溶剂作参比。如 phenFe2+标准曲线2.待测液也有吸收，被测液作参比。如 测汽水中的 Fe3.显色剂或其他试剂也有吸收，空白溶液作参比 例:邻二氮菲光度法测Li2CO3中的 Fe，参比溶液为不含Li2CO3样品的所有试剂。4.干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时：1）掩蔽被测组分，再加入显色剂，作参比.2）加入等量干扰组分到空白溶液中,作参比.,-选择适当的参比溶液,20,2.4.4 光度测量误差及测量条件的选择 光度分析的误差来源于两方面：一方面是各种化学因素引入的误差；另一方面是仪器测量不准引入的误差。对
7、于化学因素，前面巳经讲过，现在我们来看仪器测量不准引入的误差。1.仪器测量误差：任何光度计都有一定的测量误差，测量误差的来源主要是光源的发光强度不稳定，光电效应的非线性，电位计的非线性，杂散光的影响，单色器的光不纯等等因素.具体说来，对于一个给定的光度计来说，其透光率的读数误差等于常数T，约为0.010.02。T%在8010%即A=10.1时的浓度测量的相对误差较小。对于精度较好的仪器，当T%在6020%（A=0.20.7）时，测量误差约为1%。当T=0.368或A=0.434时，浓度的测量误差最小。,21,2测量波长的选择：一般选用待测物质的最大吸收波长作为测量波长（入射光）但当在最大吸收波
8、长处有干扰时，则应根据“吸收最大干扰最小”的原则来选择波长。3控制适当的吸光度范围：由测量误差可知，当吸光度在0.20.8之间时，测量误差最小，所以应尽量控制吸光度在此范围进行测定。控制的方法为：1）控制溶液的浓度；2）选用适当厚度的比色皿；,22,2.5 吸光光度法的应用,8.5.1 单一组分的测定,1.金属离子:Fe-phen,Ni-丁二酮肟,Co-钴试剂,23,3.蛋白质测定溴甲酚绿、考马司亮蓝等4.氨基酸测定茚三酮(紫色化合物)5.水质检测:NH4+、NO2-、Mn2+、Fe2+、SO42-、Hg2+-6.药物含量测定比吸光系数定量；荷移光谱法测定.7.紫外吸收(UV):NO2-、NO
9、3-、SO42-、SO32-、CO32-、SCN-、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋白质等。,24,单组分定量分析,紫外-可见吸收光谱是进行定量分析最广泛使用的、最有效的手段之一。尤其在医院的常规化验中，95%的定量分析都用此法。其用于定量分析的优点是：1)可用于无机及有机体系。一般可检测10-4-10-5 mol/l的微量组分，通过某些特殊方法(如胶束增溶)可检测 10-6-10-7 mol/l的组分。2)准确度高，一般相对误差1-3%，有时可降至百分之零点几。3)分析条件的选 定量分析方法 标准曲线法 标准加入法,25,标准曲线法,配制不同浓度的标准溶液，由低浓度至高浓度依次测定其吸收光谱，作
10、一定波长下浓度与吸光度的关系曲线，在一定范围内应得到通过原点的直线，即标准曲线。通过标准曲线可求得未知样品的浓度。标准加入法 样品组成比较复杂，难于制备组成匹配的标样时用标准加入法。将待测试样分成若干等份，分别加入不同已知量0,C1,C2,Cn的待测组分配制溶液。由加入待测试样浓度由低至高依次测定上述溶液的吸收光谱，作一定波长下浓度与吸光度的关系曲线，得到一条直线。若直线通过原点，则样品中不含待测组分；若不通过原点，将直线在纵轴上的截距延长与横轴相交，交点离开原点的距离为样品中待测组分的浓度。,26,2.5.2 多组分的测定,xl1,eyl1,exl2,eyl2由x,y标液 在1,2处分别测得
11、.,在1处测组分x,在2处测组分y.,b)在1处测组分x;在2处测总吸收,扣除x吸收,可求y.,c)x,y组分不能直接测定A1=exl1bcx+eyl1bcy(在1处测得A1)A2=exl2bcx+eyl2bcy(在2处测得A2),27,2.5.3 光度滴定,28,典型的光度滴定曲线,依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法。,29,2.5.4 络合物组成的测定,1.摩尔比法:固定cM,改变cR,30,2.等摩尔连续变化法:,31,2.5.5 一元弱酸离解常数的测定,HL HL,KaH+L/HL,高酸度下，几乎全部以HL存在，可测得AHLHLc(HL)；低酸度下，几乎全部以L存在，
12、可测得AL Lc(HL).代入整理：,或,配制一系列c相同,pH不同的溶液,测A.,HL、L 颜色不同,32,MO吸收曲线,由每份溶液的一对pH、A，可求得一个Ka,取平均值即可.,33,差示分光光度法,高含量组分的测定:配制一系列待测组分的浓度相差较小，且待测组分浓度与试液浓度相近的标准溶液，以其中浓度最小的标准溶液(Cs)作参比溶液，测定其它标准溶液的吸光度，以吸光度对测定溶液和参比溶液的浓度差作图，得一过原点的标准曲线。再在相同的条件下测定试液的吸光度，由曲线上查得试液的浓度与参比溶液浓度的差值，从而求得待测组分的浓度。Cx=Cs+Cx,34,测量原理：当试样中组份的浓度过大时，则A值很
13、大，会产生读数误差。此时若以一浓度略小于试样组份浓度作参比，则有：,具体做法：以浓度为cs的标准溶液调T=100%或A=0（调零），所测得的试样吸光度实际就是上式中的A，然后求出Cx，则试样中该组份的浓度为(Cs+Cx)。,35,Tx,常规法,Ts,落在测量误差较大的范围,落在测量误差较小的范围,Tr,Ts,示差法,结论：示差法通过提高测量的准确度提高了方法的准确度,36,8.6 紫外可见分光光度法在有机定性分析中的应用,2.6.1 有机化合物分子的电子跃迁和吸收带,HCHO,*n*n*,37,38,n*跃迁（含具n电子的杂原子）,39,n*跃迁（带孤对电子的杂原子与其他键共轭）,介质,40,
14、*跃迁（不饱和烃类),*跃迁的max短，大,n*跃迁的max长，小.,41,电荷迁移跃迁（荷移光谱）,特点：谱带宽,吸收强度大,max处的可大于104。,Fe3SCN-Fe2SCN,（分子内氧化还原）,h,R,h,DA,DA-,e给予体,e接受体,e给予体,e接受体,42,2.6.2 有机分子中的生色团与助色团,严格地说，只有含有不饱和基团或孤对电子的基团，才是生色团（n*，*）,生色团类 型,43,生色团举例-1,44,生色团举例-2,45,生色团举例-3,46,不饱和基团助色效应大,256 261 264 282 320,276(K带),苯环B带max(nm),常见助色团及其助色效应(红移
15、max增大):FCH3ClBrOHOCH3NH2NHCH3 N(CH3)2 NHC6H5O,例：CH3Cl CH3Br CH3Imax(nm)172 204 258,47,反助色团,大多是吸电子基团（蓝移）NH3SO2NH2COOCNCOOHCOOCH3 COCH3 CHO,48,共轭烯烃键数与能量的关系,共轭键越多，最大吸收峰波长 越长.,49,50,苯吸收带（溶剂：异辛烷）,51,苯环共轭的影响,52,苯的同系物的吸收光谱,53,苯环取代基的影响,(CH3)2N,2,2-二甲基联苯,二苯甲烷,54,羰基化合物,E,n,*,n*290 nm,*210 nm,n,*4,1,n*321 nm,*
16、217 nm,2,*3,脂肪醛的*n*,2-丁烯醛的 2*3 n*3,55,8.6.3 溶剂极性对吸收光谱的影响,对称四嗪的吸收光谱,蒸气状态环己烷中水中(溶剂化,精细结构消失),56,酸碱性导致物质结构发生变化,例：PP,57,溶剂极性增大，n*吸收蓝移,例:丙酮,丙酮的UV吸收光谱图,溶剂效应（形成氢键）,无溶剂效应,E1,E2,水,乙醇,己烷,A,58,溶剂极性增大，*吸收红移,CH3,异亚丙基丙酮,59,溶剂极性影响的结论:,1.非极性溶剂可见精细结构;2.pH影响分子构型,因此影响物质对光的吸收.3.利用溶剂效应可区别*(红移)还是 n*(蓝移);4.比较光谱时,溶剂要相同.,60,常用溶剂的光学透明区,大于以上波长时使用,对溶剂的要求1.低极性 2.易溶解被测物3.稳定 4.在样品的吸收光谱区无明显吸收,
