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1、发酵工程制药,第一节：微生物细胞工程（发酵工程制药）生产原理第二节：利用微生物进行药物的生产实例,一、发酵生产过程,生产用菌种-原始材料-培养基-程序-生产细则-以青霉素为例讲解,（1）青霉素（penicillin）,所用菌种-黄青霉菌原始材料-氨基已二酸、半胱氨酸、缬氨酸。发酵方法-加前体物质的深层发酵法。,青霉素发现者弗莱明,沙土管菌种转移到固体琼脂斜面培养基上，24培养5-6天，获得芽孢芽孢悬浮于无菌水中，进行摇瓶培养,进入移种瓶培养进种子罐，接种量为5%-10%进繁殖罐，28培养48-96小时进入发酵罐，开始生产。,鼓式过滤第一次萃取器纯化柱第二次萃取器第三次萃取器,真空结晶釜瓷过滤器
2、结晶洗涤釜真空干燥器（结束）,程序,（1）使用消沫剂，由于发酵过程中产生大量的CO2，会产生大量泡沫。可采用植物油、豆油、合成消沫剂进行消沫处理。（2）温度控制在24-30、PH值控制在6.8-7.2。（3）应该注意控制残糖量、还原糖量、PH值、氨、氮、溶解氧量。（4）发酵过程中要注意通气搅拌，所通入的空气必须是无菌的。（5）发酵罐必须保持正压（20-30kPa），以防罐外不洁净的空气流入。（6）目前国际上青霉素发酵的水平已经达到8万多单位/ml，相当于50g/L。,生产细则,二、灭菌技术,灭菌操作是为了保证杂菌不进入工业发酵系统。（一）灭菌项目（二）灭菌方法（三）灭菌的矛盾之处（四）具体的灭
3、菌技术,（一）灭菌项目,1、在投入生产之前，必须对设备、管道进行彻底清洗、和严格灭菌。2、对通入的培养基、通入的空气进行先行灭菌。,（二）灭菌方法,2、化学法,1、加热法,3、辐射法,4、过滤法,（三）灭菌的矛盾之处,对杀灭细菌的同时1、培养基中的营养成份也随之遭到分解和破坏。2、杀死杂菌的同时也杀死了工程细菌。,（四）具体的灭菌技术,可分为6种技术：1、间歇灭菌法2、加热灭菌法3、连续灭菌法4、空气加热灭菌法5、空气过滤灭菌法6、营养物质瞬时高温杀菌法,1：间歇灭菌法,又称为分批灭菌，是指将培养基放在发酵罐内，然后连罐加热到规定的灭菌温度。（1）灭菌方法（2）注意事项（3）间歇灭菌法的优点,
4、（1）灭菌方法,间歇灭菌的操作过程分为3个过程：加热-保温维持-冷却。这些不同的阶段，均能够起到灭菌的作用。然而，在灭菌过程中，保温杀菌的作用是主要的，冷却杀菌的作用最小。,（2）注意事项,应当避免过长的加热时间，否则常常会破坏培养基中的营养物质。系统经过灭菌操作之后，必须达到不留1个杂菌，否则，只要经过1昼夜的增殖，1个杂菌就会增加到272个杂菌，最后会导致整批发酵液的失败。,（3）间歇灭菌法的优点,设备造价低廉。便于进行手动操作。,2：加热灭菌法,隧道灭菌箱设备,3：连续灭菌法,（1）定义（2）技术分类（3）连续灭菌法的优点（4）连续灭菌法的不足,（1）定义,连续灭菌法是指灭菌的操作的加热
5、、保温维持、冷却这三个过程，在同一时间内进行。因此，在连续灭菌系统中，需要分别设置加热设备、保温维持设备、冷却设备。,（2）技术分类,连续灭菌法可以分为2种：（1）加热、冷却缓慢交替进行方法。（2）迅速升温+闪急冷却方法-这种方法称为HTST方法，这对于保证营养物质极为有利。,（3）连续灭菌法的优点,（1）可减少培养剂中营养物质的损失、提高产物收率。（2）由于操作条件恒定，可以获得稳定的灭菌质量。（3）容易实现自控操作。（4）能够避免系统的反复加热和冷却，可提高热利用率。是目前很多制药厂经常采用的方法。,（4）连续灭菌法的不足,（1）投资较大，（2）需要同时设置加热、冷却装置。,4：空气加热灭
6、菌法,利用空气压缩时产生的高温，使得微生物体内的蛋白质变性，而达到杀菌目的，这种方法称为空气加热灭菌法。不同温度下的空气细菌存活时间：200/15.1s，250/5.1s，300/2.1s，350/1.05s。干热杀菌的流程通常是：先采用废热，将空气预热到60-70，然后进入压缩机压缩，并在200以上的温度维持一段时间。以便杀死杂菌，然后再进入发酵罐之中。,5：空气过滤灭菌法,是指让空气通过过滤介质，以阻截空气中所含的微生物，取得无菌空气的目的。空气过滤分为2种：（1）绝对过滤（2）深层过滤,陶瓷过滤机,（1）绝对过滤,如超滤膜过滤就属于绝对过滤是指所用滤膜的孔径小于空气中的固体颗粒。从而把颗
7、粒截留。,（2）深层过滤,是凭借滤层内的曲折通道，而将颗粒截留的方法。它不要求滤膜的孔径小于空气中的固体颗粒。这是目前发酵工业常用的过滤除菌方法。深层过滤所用的过滤介质-棉花、活性碳、玻璃纤维、合成纤维、各种有机或无机的烧结材料（烧结金属、烧结陶瓷、烧结塑料、蒙乃尔合金粉烧结板）、超细玻璃纤维、超细玻璃纤维过滤纸，微孔聚合物（聚乙烯醇PVA过滤板、PVA烧结板等已经在日本的发酵工业中广泛应用）。,6：营养物质瞬时高温杀菌法,一般来说，当温度升高时，微生物死亡速率的增加营养物质遭到破坏的速率。因此，对于瞬时的高温，细菌常常被杀死，而营养物质则破坏得不多。根据这一原理，可以采用营养物质瞬时高温杀菌
8、法进行杀菌操作。,三、分离纯化技术,微生物的发酵产物是一种混合物，里面除了含有主要产物以外，还含有未能转化的基质和底物、残余的原料、大量的水、微生物细胞、各种杂质。因此，必须对发酵产物进行分离和纯化。分离和纯化过程被称作“下游加工过程”，需要经过以下这几个阶段：（一）固体物质的去除，（二）初步分离，（三）产品提纯，（四）产品的最终分离。,（一）固体物质的去除,1、目的2、常用的方法有3、常用的设备4、固体物质的前期预处理技术,1、目的,（1）分离出完整的细胞。（2）将细胞进行溶菌处理，提取细胞内的生物产品。（3）除去细胞有残留碎片。（4）除去没有转化的不溶性基质。（5）一部分细胞返回到反应器内
9、，进行再循环操作。,2、常用的方法,（1）过滤法-分批过滤、连续真空过滤、错流流动过滤。错流流动过滤法-使液体平等于过滤膜的表面进行流动，这样能够不断地移去在滤膜表面积累的细胞物质，从而获得近似于恒定的过滤速率。（2）离心分离法-垂直式离心、水平式离心。（3）沉降法-与一般的自由沉降不同，工业生产过程的沉降都属于干扰式沉降。,3、常用的设备,（1）过滤设备-板框过滤机、回转真空过滤机（2）离心设备-转篮式离心过滤机（三足式离心过滤机）、刮刀卸料式离心过滤机、沉降式离心过滤机、喷雾离心过滤机、间断排料式离心过滤机、倾析式离心过滤机。（3）沉降设备-管式离心沉降机。,4、固体物质的前期预处理技术,
10、由于生物反应液的粘度很大，直接分离往往比较困难，因此，常常对其进行预先的前期处理，来提高分离效果。常见的预处理技术有：（1）使细胞老化凝聚成团，（2）加热，（3）改变PH值，（4）添加化学物质促进凝聚，如加入高分子电解质、氯化钙、胶态粘士。,（二）初步分离,进一步把已经分离的溶液浓缩，提高目的产物浓度的方法，称为初步分离。初步分离的具体方法可以分为：1、蒸发2、萃取3、沉淀4、膜分离,1、蒸发,蒸发是通过加热，使溶液中的水经过汽化除去要提高溶质浓度、为溶质的析出创造条件的一种操作方法。各种代谢物，如氨基酸、抗生素、酶都可以进行蒸发操作。由于生物产品大多数是热敏性物质，所以物料在蒸发器内的停留时
11、间必须尽可能短，同时，还应该昼避免局部液体过热。,LG系列离心式刮板薄膜蒸发器示意图,蒸发设备（1）连续流动膜式蒸发器，（2）长管膜式蒸发器，（3）强制膜式蒸发器，（4）离心膜蒸发器。,2、萃取,萃取是通过物质在2种溶液之间不同的溶解度，来实现分离的操作方法。萃取的分类（1）有机溶剂萃取（2）双水相萃取,（1）有机溶剂萃取,许多抗生素都能够溶解在有机溶剂之中，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、因此，通过萃取，可使得抗生素从水相进入有机相之中，从而实现分离。由于抗生素在有机溶剂之中极不稳定，因此，在保证萃取效率的前提条件下，必须尽量缩短操作时间。有机溶剂萃取设备可使用Podbielniak离心萃取机。,SF
12、T-150超临界萃取反应仪,利用萃取法来提取抗生素，具有质量好、收率高、速度快的优点。双水相萃取法，目前用于进行酶、和蛋白质的提取工艺。,（2）双水相萃取,使用2种互不相溶的高聚物，如聚乙二醇（PEG）、葡聚糖，分别将它们溶于水中形成双水相，利用目的产物在双水相中不同的分配系数而实现分离的方法，称为双水相萃取。萃取之后的目的产物可以通过超滤法进行提纯。双水相萃取材料-（1）PEG-葡聚糖萃取系统，（2）PEG磷酸钾萃取系统。,3、沉淀,蛋白质在溶液中具有“等电点”的特性，而且其等电点与溶液PH值有关，PH值大，蛋白质呈负电，PH值小，蛋白质呈正电，当PH=pI（等电点）时，蛋白质不带电荷。蛋白
13、质在PI时的溶解度最小。这是因为蛋白质在水中有均匀分布是由于同性电荷相斥的缘故，当PH=pI时，由于蛋白质分子不带电荷，于是开始相互凝聚、产生沉淀。,NSG-630浓缩分离机,ZHN系列真空浓缩罐,沉淀和盐折的结合,由于沉淀常常导致蛋白质变性而失效。而利用盐溶液就能避免蛋白质的变性，这种方法就称为-盐析法。在不同的盐溶液之中，蛋白质有盐析效应有所不同。按下列顺序递减：（1）阴离子-柠檬酸盐-3、酒石酸盐-2、SO4-2、F-、IO3-、H2PO4-、醋酸盐-、B2O3-、Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、ClO4-、CNS-。（2）阳离子-Th+4、Al+3、H+、Ba+2、Sr+2、Ca
14、+2、Mg+2、Rb+、NH4+、K+、Na+、Li+。从离子物性来看，硫酸铵并不是盐析效应最强的盐类，但是由于它在水中的溶解度极大，对盐析十分有利，因此硫酸铵是目前最常用的盐析剂。,4、膜分离,膜分离技术是基于一种半透性薄膜，它能够使得溶液中的某些组分通过，而阻止和截留其它组分的分离方法。膜分离的优点（1）由于膜分离是纯粹物质粒度大小这一几何特性来进行分离，它不必象萃取、沉淀法那样需加入其它化学物质、也不必象蒸发那样进行加热。因此，产物的生物学特性能够得到完好的保存，（2）产物的损失量很少，有利于提高得率。膜分离的分类（1）反渗透法（2）超滤法,（1）反渗透法,根据物理化学的原理，当含有溶质
15、A的溶液B与另一渗透液C之间被半透膜隔开的时候，由于系统渗透压的作用，渗透液C 便会进入到溶液B之中，这种现象称为渗透现象。形成这种渗透的压力就自然称为渗透压（）如果在溶液B一方施加压力（P），发现渗透液C进入溶液B的速率就会减小。当压力（P）=渗透压（）时，渗透现象就会停止。当压力（P）渗透压（）时，就会看到溶液B开始反向进入渗透液C之中，这种现象就称为反渗透现象。根据溶液所具有的反渗透特性，可以实现溶液的浓缩。,（2）超滤法,是指在反渗透的基础之上，将隔离膜由原来的半透膜，改成带有较大孔径的薄膜。这样一来，在反渗透操作过程中，不但是溶剂进入到渗透液之中，就连那些许多小分子的杂质也连带一起进
16、入到渗透液之中。与反渗透法相比，超滤法明显具有其优点-反渗透法只能起到浓缩作用，而超滤法在浓缩的同时，还具有纯化作用。,反渗透法+超滤法的实际应用,（1）主要用于蛋白质溶液的浓缩、脱盐等步骤，（2）在疫苗、血浆等生产中也常被使用。膜分离装置的分类（1）中空纤维束，（2）板-框膜分离装置，（3）螺旋状膜分离装置,反渗透装置,（三）产品提纯,层析法，是指在一根层析柱内，填充某种特殊的载体物质，称为固定相。含有待分离产物的溶液则称为流动相。当流动相流过固定相的时候，由于流动相中不同的物质与固定相之间产生了不同强度的结合力，因此各种物质在层析柱内停留的时间也各不相同，结果，它们将依次序的先后流出层析柱
17、。层析法的分类1、吸附层析法2、离子交换层析法3、凝胶层析法（分子筛）4、亲的层析法,1、吸附层析法,吸附层析法是利用各种物质与固定相之间由于吸附力的差异、而产生不同的结合力的原理，所进行的层析操作。固定相对溶质产生结合力，这种结合力是以离子键、氢键、范德华力所产生的。而流动相的洗脱作用又对溶质和固定相之间产生脱离作用。这样，吸附脱离再吸附再脱离，导致溶质沿着洗脱液的方向移动。其移动速率取决于固定相对溶质的吸附能力，吸附力弱，移动就快，吸附力强，移动就慢。,2、离子交换层析法,（1）基本原理（2）离子交换过程（3）常用的离子交换树脂（4）离子交换层析法的应用,（1）基本原理,采用离子交换树脂作
18、为固定相，离子交换树脂本身具有正离子基团和负离子基团，酸性电离基团可以交换阳离子，称为阳离子交换树脂。碱性电离基团可以交换阴离子，称为阴离子交换树脂。离子交换树脂同时具备极性基团和非极性基团。极性基团不断地与溶液中的离子进行交换，而非极性基团则构成树脂分子的骨架，起支撑作用。,（2）离子交换过程,是一个同时包含吸附+吸收+穿透+扩散+离子交换+离子亲和，等等物理化学过程的综合作用的结果。,溶液中的溶质离子扩散到树脂的表面,溶质离子穿透树脂的表面,扩散到树脂颗粒的内部,溶质离子与树脂离子发生交换,树脂离子穿透树脂的表面,树脂离子扩散到溶液之中,（3）常用的离子交换树脂,（1）羧甲基纤维素阳离子交
19、换树脂（CM-纤维素）-当阳离子蛋白质流经交换树脂时，由于静电吸引的作用，蛋白质将与树脂结合，然后用缓冲液进行冲洗交换柱，结合力最弱的蛋白质首先被洗脱下来。不同的缓冲液将各处洗脱“捡到”其中的某一蛋白质组分。（2）二乙氨乙基纤维素阴离子交换树脂（DEAE-纤维素）-原理与CM-纤维素交换原理相同。,（4）离子交换层析法的应用,离子交换层析法具有收率高、质量好、周期短、成本低、设备简单、适合工业化生产等优点。目前已经普遍应用于生物化学制药行业。,离子交换柱,3、凝胶层析法,（1）基本原理（2）常用的凝胶层析材料（3）凝胶层析的应用价值,（1）基本原理,凝胶层析也称为凝胶过滤、分子筛层析、排阴层析
20、、凝胶渗透层析等等。凝胶是一种具有多孔的、网状结构的分子筛。每一个颗粒就相当于一个筛子。当样品通过凝胶层析柱时，分子量较大的物质由于直径大于凝胶网孔，它们沿着凝胶颗料的间隙流动，因此速度较快而首先流出层析柱。相反，分子量较小的物质可以自由地进出凝胶网孔，它们不断地在凝胶颗粒之中来回流动，从而导致进出速度下降。,（2）常用的凝胶层析材料,（1）葡聚糖凝胶，（2）聚丙烯酰胺凝胶。,AM90-1 型凝胶层析仪,（3）凝胶层析的应用价值,（1）可用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸等物质。能彻底分离分子量相差只有25%的二种蛋白质。（2）凝胶层析具有设备简单、分离迅速、不影响产物的分子生物
21、学特性等优点。,4、亲和层析法,是利用生物分子之间所具有的专一亲和力而设计出的一种层析方法。（1）亲和层析的原理（2）亲和层析的例子,（1）亲和层析的原理,（1）载体活化-将载体在碱性条件下用溴化氢（CNBr）进行活化。（2）通过偶联反应制成亲的吸附剂-将某一种能够与生物分子进行可逆性结合的物质（称作配基）通过偶联反应联结到载体上，（3）含有生物分子的样品通过层析柱。（4）生物分子与配基结合而被吸附，（5）未能进行特异性结合的其它杂蛋白，通过洗涤而流出层析柱。,（2）亲和层析的例子,层析目的-分离DNA解聚酶层析方法-以珠状的琼脂糖、或者聚丙烯酰胺作为载体，以DNA解聚酶的抑制物作为配基层析结
22、果-（1）DNA解聚酶被特异性地结合在层析柱上，（2）其它物质全部流出（3）最后用适当的洗脱液通过层析柱，可获得纯度极高的DNA解聚酶,四、干燥技术,干燥操作往往是生物产品生产的最后一步，干燥的目的就在于除去物料中的水分，便于保藏和运输。干燥注意事项-由于生物产品多数为热敏性物质，所以干燥过程必须注意使用那些干燥时间不太长、干燥温度不过高的设备。干燥技术和设备-（一）喷雾干燥（二）气流干燥（三）沸腾干燥（四）鼓式干燥（五）冷冻干燥,（一）喷雾干燥,喷雾干燥是利用不同的喷雾装置，如喷嘴、或者转盘，将浓缩液或者悬浮液喷成雾状，使它们形成具有极大表面积的分散液滴，在干燥室内缓缓沉降，并与热空气流发生
23、强烈的热交换，在几秒到几十秒之内得到迅速干燥的方法。喷雾干燥由于干燥时间极短、避免了生物产品活性的破坏，适用于抗生素、酶制剂、热不稳定性蛋白质的干燥。,高速离心喷雾干燥机,（二）气流干燥,是利用颗粒在气流中能够自由流动的特性，使物料与气流一起流经一段长的管道，颗粒物料在与气流一起流动的过程中，水分得到迅速汽化，因此，等到到达干燥管道出口处时，颗粒物料已经被干燥。,PG系列气流干燥机,（三）沸腾干燥,是利用流态化技术，被干燥物料由最上层逐层往下移动，而热空气则自下而上，与物料呈现逆向流动，在每层面上，使物料呈现出“沸腾状态。”称为沸腾干燥法。沸腾干燥的缺点-（1）干燥时间过短，则干燥不透。（2）
24、干燥时间过长，则生物产品的活性遭到破坏。,GFG型高效沸腾干燥机,（四）鼓式干燥,这种干燥器有二个相向转动的鼓，鼓内通入热空气，当溶液被加入到鼓面上流动时，就得到了汽化。最后，干燥的物料由刮刀刮下。鼓式干燥的应用范围-只能对那些热稳定性良好的药物进行干燥。,HZG型直接加热式回转滚筒干燥机,（五）冷冻干燥,1、基本原理2、冷冻干燥的程序3、冷冻干燥的应用4、冷冻干燥的设备,1、基本原理,又称升华干燥。将湿的物料在-50到-10之间冻结成固态，然后在高真空（1-0.001mmHg、1mmHg=133.332Pa）条件下，将其中的水分直接升华成气态，从而达到脱水、干燥的目的。,2、冷冻干燥的程序,
25、（1）冻结-一般生物制品的共晶点在-20，因此，通常将制品冻结在-35到40之间。再维持12小时，以保证冻结完全彻底。（2）升华-在低温-30到-10之间，利用高真空度（13.330Pa）时，将溶剂变成气体直接用真空泵抽走。通过升华过程，可驱除制品中90%的水分。（3）再干燥-将游离的冰晶升华完成之后，继续对制品进行加热，以驱除残余的水分。,3、冷冻干燥的应用,冷冻干燥法由于处理温度较低，对于热敏性物质的处理特别有利。适宜于抗生素、维生素的干燥。,SZG系列双锥回转真空干燥机,4、冷冻干燥的设备,（1）大规模生产设备由低温干燥箱+冷冻机+真空泵所构成。（2）小批量试制时可以在玻璃质冷冻干燥器中进行。将样品置于培养皿中，厚度不超过1cm，在冰箱中冻成硬块，再放入装有P2O5或者硅胶吸水剂的真空干燥器中，连续抽真空，来达到浓缩、干燥的目的。,
