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1、1,大肠杆菌表达系统,魔天记,2,1.大肠杆菌表达体系的组成,一个完整的大肠杆菌表达系统至少要有表达载体和宿主菌两部分构成。为了改善表达系统的性能和对各类外源基因的适应能力，表达系统有时还需要有特定功能基因的质粒或溶源化噬箘体参与。到目前为止已经成功发展了许多表达载体和相应的宿主菌。表达过程：包含启动子、目的基因编码序列和转录终止序列的载体进入受体细胞后，可以利用受体细胞的复制、转录和翻译体系表达产生目的蛋白。,3,1.1 大肠杆菌表达载体,1.1.1 组成部分 1.启动子：最佳启动子具备的条件 第一 必须是强启动子，能够克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上 第二 这个
2、启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平，因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下，使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件 第三 这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。,4,2.转录终止子 启动子封堵作用：由一个上游启动子驱动的转录作用，当其通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制，将这种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象，叫做启动子封堵作用。转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性，从而提高蛋白质产物的水平。3.核糖体结合位点 能被核糖体识别的位点，转录成mRNA分子后，核糖体在这一位点上结合。,5,4.转译起始序列 5-
3、末端结构特征，决定mRNA的转译起始效率。5.转译增强子 显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率。6.转译终止子 mRNA转译终止必须存在终止密码子。大肠杆菌格外偏爱使用终止子UAA，尤其是在其后加上U形成UAAU四联核苷酸的情况下，转译终止的效率便会得到进一步的增强。,6,启动子,核糖体结合位点,转录终止子,复制起点,7,常用的大肠杆菌表达载体 1.Lac启动子的表达载体 2.Trp启动子的表达载体 3.PL启动子的表达载体,8,lac启动子：控制编码-乳糖苷酶的lacZ基因转录的序列，可以被IPTG所诱导，所以加入诱导物后，可以诱导启动子下游的外源基因的表达。理论上，凡是具有包括控制区段
4、在内的lac操纵子的质粒，都基本上具备了用作克隆基因表达载体的条件。这类表达载体的最突出的特点是，含有一条足够大的编码-半乳糖苷酶的lacZ基因片断。因此，每当有一个克隆的外源DNA片断插入到这个启动子之后,仍保持着lacZ基因固有的读码结构时，这个重组质粒就会合成出一种由外源克隆基因编码的多肽和-半乳糖苷酶组成的融合蛋白质.,Lac启动子的表达载体,9,10,质粒的构建：将含有lac启动子的HaeIII 酶切片断，经平末端连接，克隆到经EcoR1切割并对其粘性末端进行填补修复的pBR322质粒上。,11,12,Trp启动子的表达载体 色氨酸启动子可以被色氨酸抑制，也可以很容易的被3-吲哚丙烯
5、酸诱导。这种表达载体的优点是，它所合成的蛋白质产量高于lac启动子表达载体系统，并且是诱导型的。构建：1.大肠杆菌染色体DNA的5.4kb HindIII 片断，含有trp启动子、操纵单元、前导序列、弱化子、trpE基因、trpD基因的部分序列。2.将此片断，克隆到pBR322质粒的HindIII 位点，构建成了ptrpED3表达载体（含有两个HindIII 位点）。3.HindIII部分酶切消化，将靠近EcoR1位点的一个HindIII 位点，经核酸外切酶和S1核酸酶处理，消除掉构建新的质粒载体ptrpED5-1.,13,14,PL启动子的表达载体 是一种最广泛使用大肠杆菌表达载体的启动子之
6、一.PL启动子：是负责 DNA分子转录的启动子之一。PL启动子是可以被 E.coli RNA聚合酶所识别的强启动子，转而转录噬菌体DNA。该启动子可以被cI基因产物所抑制。携带PL启动子的载体使用温度敏感的E.coli cI突变体。在较低的温度下，突变体所产生的cI蛋白可以抑制 PL启动子，在较高的温度下，蛋白失活可以导致克隆基因的转录。,15,pPLc24表达载体：用来表达天然的蛋白质和融合的蛋白质。这个质粒表达载体含有MS2-聚合酶基因开始的98个密码子，不具有转译起始密码子的外源片断也能实现表达。在MS2-聚合酶基因下游，存在BamHI和HindIII 单切点。EcoRI单切点靠近 PL
7、启动子，处于转译起始密码子之前。,16,17,T7表达系统 大肠杆菌T7噬箘体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。T7噬箘体基因1编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活T7噬箘体启动子的转录。它是一种高活性的RNA聚合酶，合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍，并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬箘体启动子的情况下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬箘体转录体系。最终受T7噬箘体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。,18,Cassettes和基因融合 一个高效的表达载
8、体不仅需要可调控的强启动子，而且需要E.coli核糖体的结合位点序列和终止子。在载体中，这些表达信号组成一个cassette。某些cassette载体，克隆的基因并不是直接的与核糖体结合位点临近，而是在一段E.coli基因之后，E.coli的基因直接与结合位点相邻。外源基因的插入必须能够融合两个阅读框架的方式进行，这样就产生了杂交的基因。因此基因的表达产物是一个蛋白质的杂交分子，包含E.coli阅读框架编码的短肽和外源基因蛋白，这样一个融合的系统具有四个优点：1)克隆基因的mRNA的高效翻译不仅依赖于核糖体结合位点的存在，而且受编码起始的核苷酸序列的影响。这可能是链间配对形成的次级结构可以影响
9、核糖体与其结合位点的结合。如果相关的序列是由E.coli序列组成，可以避免这一可能性。2)在融合蛋白中存在细菌肽可以稳定分子阻止被寄主细胞降解。3)细菌片段可能含有信号肽，引导重组蛋白运输到胞外。如ompA或者malE基因，这样重组蛋白可以被输出到细胞外，进入培养基或者质膜空间。可以简化重组蛋白从培养物中纯化。4)细菌片段可以通过亲合色谱法辅助重组蛋白的提取。例如与E.coli 谷胱甘肽-S-转移酶融合的蛋白可以吸附到含有结合谷胱甘肽的琼脂糖柱上。,19,2.外源基因在大肠杆菌细胞中的表达,外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位融合蛋白质的表达外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的稳定性,20,2.1 外
10、源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位 1.细胞质中表达:外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，常会发生一种特殊的生理现象，形成包涵体。包涵体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。影响其形成的关键因素：电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基组分,21,优点：a.蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离 b.蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用 c.蛋白质没有活性，因此不会使寄主细胞受伤害 d.蛋白质的产量高(二硫键的断裂以及转译修饰作用的丧失，会导致外源片断编码的蛋白质在大肠杆菌中超量表达。)缺点：a.折叠的蛋白质可能无法恢复其生物学活性 b.蛋白质的终产量偏低 c.蛋白质的生产
11、成本比较昂贵 d.蛋白质种类多，因此纯化比较复杂,22,2.周质中表达：周质：在大肠杆菌一类格兰氏阴性菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。在周质中表达的蛋白，需要信号肽序列才能从细胞质中穿过细胞质内膜进入周质。优点：a.目标蛋白质的纯化比较简单 b.蛋白质酶解的程度不甚严重 c.促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用（氧化环境）缺点：a.信号肽并非总是有助于蛋白质的转运 b.有可能形成包涵体,23,3.胞外表达：使克隆在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白质，分泌到胞外培养基中进行分离纯化。途径：1.用大肠杆菌细胞固有的途径，使真正属于分泌型的蛋白质直接分泌到胞外培养基中。（不是特别有效的程序）2.
12、诱导大肠杆菌细胞的外膜发生有限的渗漏，导致胞内的蛋白质向胞外培养基方向分泌。（可以分离到中等产量的蛋白质）,24,优点：1.蛋白质的酶解作用程度低 2.由于分泌到胞外的蛋白质种类少，因此目标蛋白容易纯化 3.增进了蛋白质的折叠作用 4.蛋白质N-末端的结构真实缺点：1.在大肠杆菌细胞中表达的外源真核蛋白质，通常是不会分泌到胞外培养基中去的 2.由于分泌在胞外培养基中的蛋白质相当稀释，因此目标蛋白质的纯化过程比较复杂,25,3.宿主细胞 在大肠杆菌细胞内表达目的基因的主要优势:一个是宿主的遗传背景比较清楚,易于控制基因的表达;另一个是大肠杆菌容易培养,可以获得较高产量的目的蛋白。但是在商业应用中
13、很多的蛋白产物是真核基因编码,并且具有高级的三、四级结构,要求翻译后加工为正确的折叠形式或者糖基化蛋白等。由于大肠杆菌细胞的分子环境和折叠机制等与真核细胞具有很大的差异,所以在应用大肠杆菌系统表达真核基因时有必要利用代谢工程或进化的方法改造细胞,解决大肠杆菌表达系统的局限性,提高产物的活性。,26,近几年来，国内外大肠杆菌表达系统研究的重点已从构建各种表达载体，建立新的表达系统转移到完善现有的表达系统，解决表达系统中还存在的缺陷等方面。这些研究工作主要包括重组蛋白质的正确折叠，构象形成和分泌，菌体表面表达技术及其应用，重组蛋白质修饰加工研究等内容。,4.大肠杆菌表达系统研究的新进展,27,大肠
14、杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物,28,大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素,29,5-UTR对克隆基因表达效率的影响 a.启动子结构对表达效率的影响 大肠杆菌启动子的保守序35区（5TTGACA）和10(5TATAAT)区;它们之间的距离(17bp)。b.启动子与克隆基因的间隔距离对表达效率的影响 当mRNA分子5末端与SD序列之间的长
15、度小于15bp时，转译效率下降。,影响克隆基因在大肠杆菌中的表达效率因素,30,、,2.质粒载体的生物学特性对基因表达效率的影响 a.质粒载体点的拷贝数对表达效率的影响 b.质粒载体的不稳定性对表达效率的影响,31,3.mRNA转录本的分子特性对基因表达效率的影响 a.转译起始序列对表达效率的影响 SD序列后面的4个碱基，T或A时转译作用较高，C或G时，下降50%或25%；位于起始密码子AUG上游的密码三联体的碱基，CUU或UAU时转译效率最有效，UUC、UCA或AGG时下降20倍；位于起始密码子AUG下游的密码子碱基组成，也影响转译的速率。b.mRNA的稳定性对表达效率的影响,32,4.遗传
16、密码子的使用对基因表达效率的影响 a.密码子使用的偏爱性现象的规律性 几乎在所有的简并密码子家族中，都有一个或两个是优先使用的偏爱性密码子；一些密码子在各种不同基因中都是最常用的（在编码脯氨酸4种同义密码子，CCC是优先使用的）高表达活性的基因比低表达活性的基因，呈现出较高程度的密码子偏爱性 简并密码子的使用频率，反应它们相应的tRNA丰度。,33,b.密码子使用偏爱性对基因表达效率的影响 富含大肠杆菌罕用密码子的外源真核基因，很难在大肠杆菌转化子细胞中得到有效的表达。不同生物密码子的偏爱性，是阻碍外源基因在大肠杆菌中高效表达的一种重要因素。,34,5.寄主细胞的生理状态对基因表达效率的影响 培养基营养成分的选择、细胞培养方式、培养温度等环境因素能影响大肠杆菌生理状态。,35,
