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1、与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。从最开始以裸露DNA直接转染哺乳动物细胞至今的30余年间，哺乳动物细胞表达系统不仅已成为多种基因工程药物的生产平台，在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用。,研究现状 部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向生产或中试生产阶段。已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子、干扰素、乙肝表面抗
2、原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素，集落刺激因子等。有些产品已投入临床应用或试用。虽然经过多年努力，哺乳动物细胞表达系统的表达水平有大幅度增高，但从整个水平上看仍偏低，一般处在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即1-30g/l08细胞/24小时。有人认为其限速步骤可能是在工程细胞中重组蛋白的分泌效率较低。,1 表达载体 11 表达栽体的类型 哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。根据进入宿主细胞的方
3、式，可将表达载体分为病毒载体与质粒载体。,病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒(sFv)载体等。另外，杆状病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达在近几年颇受重视。,质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载体分为整合型和附加体型载体两类。整合型载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能稳定存在。而附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式存在。整合型载体一般是随机整合入染色体，其外源基因的表达受插入位点 的
4、影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性。相比之下，附加体型载体不存在这方面的 问题，但载体DNA在复制中容易发生突变或重排。,载体的选择取决于外源基因的导入方式和其调控元件是否有利于转录和翻译。真核生物基因高表达载体必须具有如下调控元件：原核DNA序列，包括能在大肠杆菌中自身复制的复制子，便于筛选含萤组细菌的抗生素抗性基因，以及便于目的基因插入的限制性酶切位点。启动子和增强子；剪接信号；终止信号和polyA加尾信号。,为了将含目的基因的载体导入哺乳动物功物细胞还必须加入遗传选择标记。常用的标记基因有胸腺激酶(tk)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因、新霉素(neo)抗性基因、氯霉素乙酰基转
5、移酶(cat)基因等.dhfr还可作为共扩增基因使外源基因的表达产物增加。当培养基中逐新增加氨甲蝶呤(MTX)的浓度时，随着细胞对MTX抗体的增加。dhfr基因与外源基因均明显扩增。据文献报道，在不断提高的选择压力下，dhfr及侧翼序列能扩增至上千个拷贝，大大增加目的基因的表达水平。,12 表达载体的结构元件 哺乳动物细胞表达载体的必要元件包括：一个高活性的启动子、转录终止序列和一个有效的mRNA翻译信号。可视实验需要加入标志基因、复制起始点序列、内部核糖体进入位点等。基于启动子增强子是表达载体中最重要的元件，我们这里仅对它做简要介绍。,目前常用的强启动子包括人巨细胞病毒早期启动子(CMV-I
6、E)、人延伸因子1-亚基启动子和Rous肉瘤长末端重复序列；Invitrogen公司开发的pcDNA、pEF和pRL三种系列载体即分别是以这三种启动子驱动目的基因的表达。常用的增强子有Rous肉癯病毒基因长末端重复序列和人巨细胞病毒增强子。构建杂合的启动子是获得新启动子的一个重要途径。,2宿主细胞 哺乳动物细胞表达外源蛋白最初是将抗体基因重新导人淋巴细胞中由病毒(如SV40)或lgG的启动子增强子引导。产生的抗体具有相应的结合能力和数应功能，但表达量很低。常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等。不同宿
7、主细胞表达的重组蛋白其稳定性和蛋白糖基化类型不同，需根据要表达的目的蛋白选择最佳的宿主细胞。,COS细胞是进行外源基因瞬时表达时用途最广的宿主，其重组载件易于组建，便于使用，而且对插入DNA的量或者采用基因组DNA 序列的情况都没有什么限制，便于通过检测表达情况来确证cDNA的阳性克隆，也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突变。,CHO细胞则利于外源基目的稳定整合，易于大规模培养，能在无血清和蛋白的条件下生 比，是用于真核生物基因表达软为成功的宿主细胞。已用于多种复杂的重组蛋白的生产，但其产量较低，一般仅占细胞蛋白的2.5%，而用细菌表达可获得占总蛋白50%的蛋白表达水平.,3 表达系统
8、根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分为瞬时、稳定和诱导表达系统。瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达载体后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失，目的蛋白的表达时限短暂；瞬时表达系统的优点是简捷，实验周期短。大规模的瞬时表达技术是 近年来的一个研究热点。已有报道能放大到100 L反应器中生产重组蛋白，产量(分泌型蛋白)可达l10 mg/L。不过该方法技术条件要求高，如质粒的纯度、转染的效率等。,稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培养，载体DNA稳定存在于细胞内，目的蛋白的表达持久、稳定。由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗力。诱导表达系统是指目的基因的转录受外源
9、小分子诱导后才得以开放。早期实验常使用糖皮质激素、重金属离子等诱导体系来调控基因表达，但存在特异性低和毒性高等诸多缺点；,4 表达系统的选择哺乳动物细胞表达系统中，重组蛋白的表达水平与许多因素相关，如转录和翻译调控元件、RNA剪接过程、mRNA稳定性、基因在染色体上的整合位点、重组蛋白对细胞的毒性作用以及宿主细胞的遗传特性等。选定表达系统之后，还需考虑表达载体与宿主细胞的合理搭配问题。因此如果需获得一个基因的高表达。最好多试用几种不同的载体及宿主细胞。,提高蛋白表达产量的措施 1转录水平 在目的基因拷贝数一定、整合位点固定的情况下，转录作为基因表达的第一步，提高转录效率对一个高效表达载体的构建
10、来说显得尤为重要。启动子及其相应增强子、转录终止信号及polyA加尾信号对转录水平的高低及mRNA的稳定性有很大影响，其中强启动子、强增强子是提高转录水平的关键因素。随着真核细胞在转录水平调控机制的进一步揭示，杂合(或人工)启动子以及人工转录激活因子的构建将是更为有效的提高转录效率的方法。,2 翻译水平 除了转录水平的调控外，翻译水平的调控(如mRNA寿命、mRNA的翻译起始效率)和翻译产物的加工修饰的效率等也对目的基因的表达产生重要的影响。poly(A)的存在不但能影响mRNA稳定性，而且也能部分起“翻译增强子”的作用，提高mRNA翻译水平；内部核糖体进入位点(IRES)能使同一mRNA中除
11、第1个基因之外的其他基因也得到有效表达；翻译增强子可提高翻译效率；通过使用宿主细胞偏爱的密码子来对目的基因的密码子进行优化也可以大幅度提高翻译效率,3 整合位点的优化 目的基因在CH0细胞染色体上整合位点区域的状态对于目的基因的表达与否、表达高低以及目的基因在宿主细胞中的稳定性起着决定性的作用。只有那些整合位点处于染色体转录活跃区的细胞形成的克隆才可高水平表达目的基因。因此，保证将表达载体整合在CHO细胞染色体上转录活跃位点的克隆挑选出来是提高CHO细胞表达水平必需的一步,4 增加目的基因拷贝数 单拷贝或低拷贝目的基因，无论表达载体调控元件如何优化、整合的染色体位点多么合适，其外源基因表达量都
12、是有限的。因此，通过增加目的基因拷贝数来获得高表达重组药物的CHO细胞工程株是基因工程药物研究中不可或缺的一步。,5 宿主细胞的改造 随着对细胞周期、细胞凋亡、信号传导，以及细胞周期的调控机制等各方面机理认识的不断深入，可以通过载体的系统优化，将编码细胞生长刺激因子、黏附因子、扩展因子、抗凋亡因子、转录翻译的反式作用因子以及其他细胞生长存活所必需的成分的基因和顺式表达调控元件敲人宿主细胞，以提高其表达；与此同时把不利于目的基因表达的基因从宿主细胞中敲除或下调其在宿主细胞中的表达，从而把细胞改造为能在PFM中培养、培养的前期细胞增殖快、当细胞密度达到理想值时细胞长时间不增殖、抗凋亡能力强、高表达目的基因的宿主细胞，最终大幅度降低哺乳动物细胞生产蛋白质类药物的成本。,
