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1、实时荧光定量PCR仪校准规范1范围本规范适用于实时荧光定量PCR仪的校准，其他类型PCR仪相同原理部分可参照本规范执行。2引用文件本规范引用了下列文件：JJF1527聚合酶链反应分析仪校准规范YY/T1173聚合酶链反应分析仪JJF1101环境试验设备温度、湿度参数校准规范凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本规范；凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本规范。3术语和计量单位3.1 PCR(聚合酶链反应)polymerasechainreactionPCR即聚合酶链反应是一种对特定的DNA或RNA片段在体外进行快速扩增的方法,由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成
2、。(YY/T1173-2010)3.2 PCR仪(聚合酶链反应分析仪)polymerasechainreactionanalyzer,PCRanalyzer基于PCR技术原理，模拟DNA或者RNA的复制过程，在模板、引物、聚合酶等存在的条件下，特异扩增已知序列，对其进行检测分析的仪器设备。(YYT11732010)3.3 实时荧光PCRreal-timepolymerasechainreactionPCR在PCR过程中利用荧光染料释放的荧光能量的变化直接反映出PCR扩增产物量的变化，荧光信号变量与扩增产物变量成正比，并通过对荧光的采集和分析以达到对原始模板量进行分析的PCR0(YY/T1173
3、-2010)注：在每个循环中监测扩展产物是否可被检测。3.4 温度示值误差temperatureindicationerror荧光定量聚合酶链反应分析仪均热块设定温度值与实际温度平均值之差。单位：摄氏度，符号：3.5 温度均匀度temperatureuniformity均热块内所有采样测量孔温度孔温度平均值的最大值与最小值之差。单位：摄氏度，符号：3.6 温度波动度temperaturevolatility在被检设备稳定的状态下，在规定的时间间隔内，均热块所有采样点中任意一点温度随时间的变化量。冠以“土”号。单位：摄氏度，符号：3.7 温度最大过冲量temperaturemaximumover
4、shoot均热块温度升高或降低至设定值过程中，所有采样测量孔温度超出(高于或低于)设定值的最大幅度。单位：摄氏度，符号：C。3.8 平均升,温速率meanheatingrate升温过程中模块单位时间内上升的平均温度度数。单位：摄氏度每秒，符号：/s。(YY/T1173-2010)3.9 平均降温速率meancoolingrate降温过程中模块单位时间内下降的平均温度度数。单位：摄氏度每秒，符号：C/s。(YY/T1173-2010)3.10 荧光染料Auorochrome由短波长激发光激发，释放出可见光的试剂。(YY/T1173-2010)3.11 荧光强度精密度precisionoffluo
5、rescenceintensity对多个检测孔在同一荧光条件下重复荧光强度检测，其检测值的一致性。(YYT11732010)3.12 阈值循环数Ct(Cp)cyclethreshold,crossingpoint实时监测扩增过程中，反应管内的荧光信号到达指数扩增时经历的循环周期数。主要的计算方式是以扩增过程前315个循环的荧光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值时的循环数则为阈值循环数(Ct)。(YY/T1173-2010)3.13 阈值循环数精密度precisionofcyclethreshold均热块不同测量孔在同一荧光条件下阈值循环数重复测量的一致性。3.14 熔解温度melttem
6、perature(Tm)总的DNA双螺旋结构降解一半时的温度称为熔解温度,简称Tm值,不同序列的DNA,Tm值不同。单位：摄氏度，符号：C。3.15 熔解曲线meltcurvePCR过程中均热块测量孔的荧光强度(纵坐标)与温度(横坐标)形成的曲线。3.16 熔解温度漂移melttemperature()bias根据熔解曲线计算的熔解温度值与光学标准器熔解温度设定值之差。单位：摄氏度，符号：。3.17 峰值强度peakintensity熔解曲线上熔解温度对应的荧光强度。3.18 通道峰值强度一致性channelpeakintensityconsistency(CPHC)熔解曲线上，所有采样测量孔
7、峰值强度的变化趋势。峰高的差异表明荧光定量PCR仪的光路、光学、光学检测和灵敏度的差异，理想的荧光定量PCR仪，CPHC为LOOo3.19 线性灵敏系数IinearSenSitiViIyfaClor(LSF)同一熔解温度下，表征熔解曲线线性变化灵敏程度的比率。理想的荧光定量PCR仪，线性灵敏度应该是1.00。LSF在0.80和1.20之间，溶解曲线呈现基本线性；1.SRVo.80：在高荧光强度下线性降低，注意信号饱和；1.SF.20:在低荧光强度下线性降低，注意最小信号检测和灵敏度。3.20 熔解温度比ratioofmelttemperature(RTm)同一熔解温度下，表征熔解温度漂移因素的
8、比率。在0.80到1.20之间：相同产品熔解温度不同，差异仅基于控温模块特性，熔解峰漂移与温度不均匀直接相关；HTm1.20：相同产品熔解温度不同，差异是由控温模块、光学和光学检测系统不准确共同导致的；RTm0.80：相同产品熔解温度不同，差异是与光学、光学检测系统及分析软件直接相关。3.21 样本示值误差errorofsamplesindication被测仪器测量平均值与标准物质标称值之差。单位：拷贝数/微升，符号：copyiesLo3.22 样本线性Samplesofthelinear系列稀释标准物质扩增Ct值对浓度对数值的线性回归系数。4概述实时荧光定量PCR仪，全称为实时荧光定量聚合酶
9、链反应分析仪（real-timefluorescentquantitativePCRanalyzer,RFQ-PCR,以下简称实时荧光定量PCR仪）是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，同时通过标准曲线对扩增基因进行定量分析的仪器。标记有荧光染料的探针与模板基因混合后，完成高温变性、低温复性和适温延伸的热循环后，与模板基因互补配对的探针被切断，荧光染料游离于反应体系中，在特定光激发下荧光染料发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化的荧光信号强度，既可对待测扩增基因进行定量分析。实时荧光定量PCR仪均
10、热块一般有32孔板、48孔板、96孔板和384孔板等几种类型，其中96孔板应用最为广泛。如图1所示，其主要由温度控制模块、微量荧光检测模块、均热块、电脑控制系统、计算机及应用软件组成。图1实时荧光定量PCR仪结构示意图5计量特性一般情况下，实时荧光定量PCR仪计量性能指标如表1所示。序号项目技术指标备注1温度示值误差30C5060709095+0.5温度项目2温度均匀度1.5oCs6平均降温速率90oC50oC1.50Cs7阈值循环数示值误差2.5光学系统物理项目8阈值循环数均匀度59阈值循环数精密度0.980表1实时荧光定量PCR仪计量性能指标6校准条件仪器使用允许的环境条件，测量过程中应测
11、量和记录环境的温度、相对湿度。6.1 测量标准及标准物质6.1.1 光学标准器光学标准器集成了温度传感器和发射光发生器两部分，该两部分可以为集成装置。其温度测量范围为（0120）,最大允许误差为0.1；发射光发生器的波长范围为（360780）nm,相对光辐射强度在（10%100%）范围内可调。6.1.2 标准物质校准时应采用国内外有证标准物质，包括：质粒DNA标准物质、核糖核酸标准物质，其特性量值（拷贝数N10%opiesL,相对扩展不确定度5%）。6.1.3 电子天平精度WSOlmg,且需要计量检定合格。6.1.4 移液器规格：2L10L100L,200L1000L,且需要计量检定合格。校准
12、前按照附录A配置校准时使用的溶液。7校准项目和校准方法7.1 校准项目校准项目主要分为温度项目和光学系统项目两大类，具体项目见表K可根据客户要求与实际情况选择光学系统物理校准方法或光学系统生物化学校准方法中的一种方法对荧光定量PCR仪光学系统进行校准。7.2 校准方法7.2.1 校准前的准备工作PCR仪均热块孔数少于96孔时，测量点为12个，布点图（以48孔为例）如图2所示。PCR仪均热块孔数大于或等于96点时，测量点为15个，布点图如图3所示。也可以根据被测PCR仪说明书或客户要求，增加或减少测量点数量，并图示说明。校准前将PCR仪预热30mino将仪器及光学标准器各部件连接完好，在光学标准
13、器下部的温度传感器表面上涂抹适量导热油，以确保其与均热块测量孔接触良好。将光学标准器分布于均热块测量孔中。标准物质的准备与配置按照附录A执行。PCR反应体系的配置按照附录B执行。7.2.2校准过程温度项目校准时，典型的校准设置程序如表2步骤411所示（其中平均升、降温速率的测量数据分别来源于步骤4到步骤5和步骤5到步骤6；温度示值误差的测量数据来源于步骤5-11；温度均匀度、温度波动度、温度最大过冲量的测量数据来源于步骤510。光学系统采用物理校准方法时，典型的校准设置程序如表2步骤1216所示（步骤12和步骤13之间设定程序循环32次）。光学系统采用生物化学校准方法时，典型的校准设置程序如表
14、3所示。也可以根据被测PCR仪说明书或客户要求，参照表2或表3进行设定，并说明具体参数校准时所选取的温度值。步骤设定温度点持续时间备注13060s预热29560s33060s43060s温度控制595180s630120s790180s850C180s970180s1060180s113060s1285IOs模拟光学扩增过程重复32个循环136030s149515s扩增变性156030s熔解曲线分解1685IOs表2温度校准控制程序步骤设定温度点持续时间循环数150120s1295600s139530s4546060s表3光学系统采用生物化学校准方法的校准设置程序7.2.3温度项目校准7温度示
15、值误差温度达到设定温度30s后开始记录测量值，记录5s,最少均匀记录5组数据。温度示值误差的计算按照公式（1）计算：=s-fji式中：丁温度示值误差，;Ts设定温度值，C；Ti第i个温度传感器测量值平均值，n温度传感器数量。7温度均匀度温度达到设定温度30s后开始记录测量值，记录5s,最少均匀记录5组数据。温度均匀度的计算按照公式（2）计算：=Tmax-Tmin（2）式中：AT温度均匀度，；看ax所有测温传感器测定值平均值的最大值，；所有测温传感器测定值平均值的最小值，。7温度波动度温度达到设定温度30s后开始记录各点量值，记录60s,最少均匀记录10组数据。温度波动度为实测最高温度与最低温度
16、之差的一半，冠以“土”号。按照公式（3）计算:=max（.lax-min）2（3）式中：7;温度波动度，；测量点j温度传感器在m次测量中的最高温度，C；lmax测量点/温度传感器在用次测量中的最低温度，。2min7温度最大过冲量温度过冲量的计算按照公式（4）计算：U=IlmaXYl式中：t;温度最大过冲量，；max上升或下降达到设定温度后，所有温度传感器测得的温度最高或最低测量值，；TS设定温度值，平均升温速率被测实时荧光PCR定量仪从（500.5）C升温至（900.5）C时，平均升温速率的计算按照公式（5）计算：-Tai_5（5）n式中：th平均升温速率，/s；Tai（500.5）C温度点第
17、i个采样测量孔的测量值，C；Thi（900.5）C温度点第i个采样测量孔的测量值，；thi从到达7；的时间，s；n温度测量点的个数。平均降温速率被测实时荧光仪定量PCR仪从（900.5）C降温至（500.5）C时，平均降温速率的计算按照公式（6）计算:Tb-Tai7c=-匕(6)n式中：盘一一平均降温速率，。C/s；tci从Tbi到达Tai的时间，so7.2.4光学系统物理校准法阈值循环数示值误差、均匀度和精密度阈值循环数Ct示值误差的计算按照公式(7)计算，均匀度的计算按照公式(8)计算,精密度按照公式(9)计算Ct值的相对实验标准偏差，以其作为Ct值精密度的表征。C,=.-C,s(7)=G
18、qmax-Cqmin1lS6、S?为SO系列稀释后的样品，每步样品配制后要充分震荡混匀，详细配制方法见表A.1。表A.1标准物质系统稀释配制mg项目SoSiSaS3S4SSS6S7H2O终浓度(copies/L)Si100900IXlO8S2100900IXlO7S3100900IXlO6S4100900l105S5I(X)900l104S6100900l103S7100900IXlO24.未知样品的配制以配制好的S3为起点，用经过校准的天平(0.0Img)配制未知样品1(Ul)和未知样品2(U2),样品配制后要充分震荡混匀，详细配制方法见表A.2。mg表A.2标未知样品的配制项目S3UiH2
19、O终浓度(COPieS/AL)Ul5005005.0IO5U23503502.5IO5附录BPCR反应体系的配制1 .试剂ddH2O、IOXPCRbuffer25mmolLMgChdNTPs10mol/LProbe10Umol/LPrimer1、10Umol/LPrimer2、5UuLTaqenzyme、DNAo2 .仪器移液器，规格2uL、10uL、lOOuL、2000L.100OuL,且需要通过计量检定。3 .PCR反应体系的配制参照表B.1进行PCR反应体系溶液的配制。表B.1PCR反应体系的配制试剂终浓度体积ddH2O/20.6L10PCRbufferIx5L25mmolLMgCh2.
20、5mmol/L5LdNTPs0.2mmol/L4L10molLProbe0.2molLlL10molLPrimer10.4molL2.0L10molLPrimer20.4molL2.0L5ULTaqenzyme0.04UL0.4LDNA/10.0Ltotal/50L注：1如果Mg2+、dNTPs和Taqenzyme已经在IOXPCRbuffer,不需要加，如果使用2xPCRbuffer,调整加样体积使浓度合适。2ddH2为灭菌双蒸饱水，Probe为荧光标记探针，Primer为引物，Taqenzyme为热启动酶，buffer为缓冲溶液，(INTPs为四种脱氧核糖核甘-磷酸混合物。附录C温度示值误
21、差和阈值循环数示值误差测量结果的不确定度评定示例C.1温度测量结果不确定度评定C.1.1测量方法将实时荧光定量PCR仪及PCR扩增光学标准器各部件连接完好，在PCR扩增光学标准器的温度传感器表面上涂抹适量导热油，将15个温度传感器置于仪器加热模块中，并确保与加热模块接触良好。按照仪器说明书或用户要求或推荐使用的温度控制程序，并运行该程序，同时启动PCR扩增光学标准器进行温度数据采集。温度示值误差的计算按照公式（CLl）进行计算。C.1.2测量模型115t=t;Zz（c.i）15,=1式中：T一一采样测量孔内温度示值误差，C；TS一一仪器设定温度值，；Ti第i个温度传感器测定值，C。C.1.3不
22、确定度来源根据上述数学模型以及测量方法，其不确定度来源主要包括以下三个方面：a）测量重复性引入的标准不确定度分量内；b）温度传感器分辨力引入的标准不确定度分量c）温度传感器准确度引入的标准不确定度分量2；C.1.4测量不确定度评定C.I.4.I重复性测量引入的不确定度分量i以95C为例，对同一台仪器，在相同的测量条件下，重复测量10次，温度稳定后读取温度测量值，15个温度传感器的重复测量数据见表C.l.lo表CLl温度测量结果测量立、不同测量点温度传感器测量结果（C）12345678910Al95.0194.9895.0194.9594.9894.9895.0195.0495.0194.98A
23、495.2295.2295.2595.2595.2895.2295.1995.2295.1995.22A794.9394.9394.9394.9694.9394.9694.9394.9994.9194.96AIO95.2695.2695.2695.2695.2695.2995.2695.2995.2695.26A1295.4995.4095.4095.4995.4695.5295.4695.4695.5295.46Dl95.0395.1595.0995.0995.0395.1295.0695.0995.0995.06D794.9094.8794.8794.8294.9394.9094.8794
24、.8494.8794.87D1295.3795.2695.2995.2995.3295.2095.2995.2995.3595.29E494.9494.8594.8594.8594.8594.9494.8894.8594.9794.91ElO95.3795.2895.3495.2895.3495.3795.3195.2895.3495.31Hl95.4795.4795.5095.4795.5095.5095.4795.4795.4795.50H495.0395.1295.0695.0695.0395.0995.0695.0695.0995.06H795.0395.0095.0395.0095.
25、0095.0095.0095.0695.0095.00HlO95.2595.2895.2595.3195.3195.2595.2895.2595.2595.28HI295.0194.9895.0194.9894.9594.9895.0194.9595.0395.01合并样本标准偏差按公式(C.1.2)计算：X)2S=IL(C.I.2)pV/77(/7-1)式中：m测量点的数量；n每个测量点测量次数；第j个测量点第k次的测量值，；X第j个测量点测量值的平均值，;通过(C.1.2)计算出合并样本标准偏差如下：SP=O.0313由于每个点测量5次取平均值，因此重复测量引入的不确定度分量为:=0.01
26、34 C.1.4.2温度传感器分辨力引入的不确定度的温度传感器的分辨力为0.01,分散区间半宽为0.005,按均匀分布计算，k=3,则%为：w=-oC=0.003oC由于重复测量引入的标准不确定度分量大于分辨力引入的标准不确定度分量一两者具有一定的相关性，因此在不确定度计算时不考虑由读数分辨力引入的标准不确定度分量。C.1.4.3温度传感器准确度引入的标准不确定度分量U2；温度传感器的最大允许误差0.1C,按均匀分布计算，则:0.1 = 0.058 C.1.5合成标准不确定度心wc=ww2=006cC.1.6扩展不确定度U取女=2,则：U=kwf=0.12CC.2阈值循环数测量结果的不确定度评
27、定C.2.1测量方法将实时荧光定量PCR仪及光学标准器各部件连接完好，将光学标准器的置于仪器加热模块中，并确保与加热模块接触良好。按照仪器说明书或用户要求或推荐设置光学扩增程序，并运行该程序，同时启动PCR扩增光学标准器进行温度和光学数据采集。示值误差的计算按照公式（C21）计算。C.2.2测量模型Cti=Clqi-Cts（C.2.1）式中：Cti阈值循环数示值误差；Ctqi一一被测设备第i个采样孔的阈值循环数；Cts光学标准器第i个采样孔的阈值循环数；C.2.3不确定度来源根据上述数学模型以及测量方法，其不确定度来源主要包括以下三个方面：a）测量重复性引入的标准不确定度分量小;b）光学标准器
28、分辨力引入的标准不确定度分量；c）标准器具引入的标准不确定度2；C.2.4测量不确定度评定C.2.4.1重复性测量引入的不确定度分量对对同一台设备，在相同的测量条件下，使用光学标准器按照推荐的光学扩增程序对其阈值循环数进行10次重复测量，对重复测量结果进行分析，测量结果表C.2.1所示：表C.2.1阈值循环数测量结果数测i阈值循环数测量结果12345678910Al11.3411.3711.2311.5611.5611.6411.7311.7611.2811.77A411.5511.7511.5611.2411.8411.3811.4211.3611.3711.35A711.5011.2411
29、.2411.6311.7311.3711.5711.3711.5411.57实AlO11.2311.7311.6411.2511.5311.5611.3511.3611.6911.37时A1211.7811.2711.2511.0711.6511.3711.3311.8311.5311.74荧Dl11.3311.7511.7311.8411.2411.8711.7311.5511.4811.35光D711.4511.2311.2411.2511.2611.3811.2911.5811.3711.38定D1211.7711.8911.5711.6411.5211.9711.29113811.46
30、11.46量E411.2411.6411.8511.2811.7311.6311.7811.4711.3611.56PCEIO11.9611.8611.9511.8411.3711.6811.7311.2911.7411.37RHl11.7511.2211.3511.3411.7411.2511.4711.2811.2611.66仪H411.3511.4511.6711.6611.2711.3711.6711.7811.7311.33H711.7611.7611.2411.6311.8311.4211.3611.5611.3811.34HlO11.3211.5511.1111.3211.551
31、1.5311.3711.3711.3311.37H1211.7711.3411.7411.7711.4411.6211.8311.8311.1111.38Al11.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50A411.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50A711.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50AlO11.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50A1211.5011.501
32、1.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50光Dl11.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50学D711.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50标D1211.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50准E411.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50器ElO11.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5
33、011.50Hl11.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50H411.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50H711.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50HlO11.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50H1211.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50合并样本标准偏差按公式（C.L2）计算:In(C.2.2)j=l
34、A=Im(n-)式中：机测量点的数量；每个测量点测量次数:第j个测量点第k次的测量值，；为一第j个测量点测量值的平均值，；通过（C.2.2）计算出仪器的Ct值合并样本标准偏差SPq和PCR扩增光学模拟器的Ct值合并样本标准偏差SPS如下：Spq=0.042CSps=O因此重复测量引入的不确定度分量内M1=0.0421C.2.4.2光学标准器分辨力引入的不确定度分量对PCR扩增光学标准器的分辨力为0.01,分散区间半宽为0.005,按均匀分布计算，则“华=0.0033由于重复测量引入的标准不确定度分量对大于分辨力引入的标准不确定度分量,两者具有一定的相关性，因此在不确定度计算时不考虑由读数分辨力引入的标准不确定度分量/OC.2.4.3标准器具引入的不确定度町针对光学标准器，需要考
