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1、氨基酸、多肽与蛋白质,第四章,Amino Acids，Peptides and Proteins,病例：老年痴呆症 蛋白质结构变化引起疾病,记忆力明显减退，经常忘记刚刚说过的话或做过的事，对于熟悉的人或物品，不能回忆其名称。语言不流畅，经常间断，与人交流困难，睡眠欠佳，表情淡漠，反应迟钝。,分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：占人体干重的45，某些组织,例如脾、肺及横纹肌等高达80。,蛋白质的生物学重要性,1.蛋白质是生物 体重要组成成分(结构蛋白),Protein derives from Greek protos，meaning“first”or“for
2、emost”.,1）作为生物催化剂（酶）2）代谢调节作用3）免疫保护作用4）物质的转运和存储5）运动与支持作用6）参与细胞间信息传递,2.蛋白质具有重要的生物学功能(功能蛋白),3.氧化供能,什么是蛋白质?,蛋白质（protein）是由许多氨基酸（amino acids）通过肽键（peptide bond）相连形成的高分子含氮化合物。,氨基酸,第一节,Amino Acids,一、组成人体蛋白质的20种氨基酸 均属于L-氨基酸,自然界中氨基酸300余种，人体蛋白质氨基酸20种，均属 L-氨基酸（甘氨酸除外）。,COOH COOH H2NCH HCNH2 R R L-氨基酸 D-氨基酸,C,+,N
3、,H,3,C,O,O,-,H,二、20种氨基酸的分类：根据侧链结构和性质不同,（一）非极性疏水性氨基酸（二）极性中性氨基酸（三）芳香族氨基酸（四）酸性氨基酸（五）碱性氨基酸,（一）非极性疏水性氨基酸：侧链是非极性（疏水）的氨基酸 订正P53,(二)极性中性氨基酸:侧链是极性、不带电荷的氨基酸-OH、-SH、-CO-N2H,(三)芳香族氨基酸：侧链含芳香基团的氨基酸（苯基、酚基和吲哚基）,(四)酸性氨基酸：侧链含负性解离基团的氨基酸（羧基）,(五)碱性氨基酸 侧链含正性解离基团氨基酸 氨基、胍基和咪唑基,几种特殊氨基酸,脯氨酸（亚氨基酸）,CHCOO-,半胱氨酸,胱氨酸,三、氨基酸的理化性质,（
4、一）氨基酸具有两性解离性质,氨基酸在不同酸碱度溶液中解离成带不同电荷的离子。,在特定pH溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子程度相等的兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。,等电点（isoelectric point，pI）,pH=pI,pHpI,pHpI,兼性离子A0,阳离子A+,阴离子A-,K1=A0H+/A+K2=A-H+/A0,K1,K2,A+A0+H+,A0 A-+H+,pI=(pK1+pK2)/2,（二）氨基酸具有特征性的滴定曲线,甘氨酸滴定曲线,（三）紫外吸收性质,色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280nm 附近。,测定280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的
5、快速简便的方法。,芳香族氨基酸的紫外吸收,含共轭双键的氨基酸,（四）氨基酸参与多种化学反应,1、氨基酸分解生成氨气：氨基酸定量和蛋白质定量,2、生成萤光氨基酸：二硝基氟苯（DNFB）N-末端氨基酸测定,醛 氨基酸 Schiff碱,3、生成Schiff碱：氨基酸代谢重要反应过程,4、茚三酮反应,氨基酸与茚三酮共热，生成蓝紫色化合物，最大吸收峰为570nm，吸收峰值与氨基酸含量成正比，氨基酸定量分析方法。,5、2个氨基酸成肽反应,多肽和蛋白质Polypeptides and Proteins,第二节,一、多肽和蛋白质是氨基酸的多聚体,（一）氨基酸是多肽与蛋白质的基本组成单位,氨基酸通过肽键(pep
6、tide bond)相互连接而形成多肽和蛋白质。肽键：由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的酰氨键。,+,甘氨酰甘氨酸,肽键,肽：氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。,二肽：两分子氨基酸残基缩合形成三肽：三分子氨基酸残基缩合形成，寡肽：十个以内氨基酸相连，(oligopeptide)多肽：由更多的氨基酸相连，(polypeptide)蛋白质：51个氨基酸氨基酸残基(residue):肽链中的氨基酸分子;因为氨基酸脱水缩合使基团不全。,O O O NH2-CH-CNH-CH-CNH-CH-C-NH-CH-COOH R1 R2 R3 Rn,多肽链(polypeptide chai
7、n)：许多氨基酸通过肽键连接而成的一种链状结构。,主链结构:氨基酸残基通过肽键连接而成的结构。侧链结构：氨基酸残基 R基团结构。,氨基末端（N 末端）：多肽链中有自由氨基的一端羧基末端（C 末端）：多肽链中有自由羧基的一端多肽链方向性：从氨基末端走向羧基末端,O O O NH2-CH-CNH-CH-CNH-CH-C-NH-CH-COOH R1 R2 R3 Rn,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,（二）体内存在多种重要的生物活性肽,1.谷胱甘肽是体内重要的还原剂,谷胱甘肽(glutathione,GSH),GSH功能：GSH的巯基具有还原性：保护蛋白质或酶分子的巯基免遭氧化，维持蛋白质或酶活性状态。
8、GSH还原H2O2GSH与致癌剂或药物结合,2.体内有许多激素属寡肽或多肽,3.神经肽是脑内一类重要的肽 在神经传导过程中起重要作用的肽类。,组成蛋白质的元素：,主要有C、H、O、N和S。有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘。,二、蛋白质的分子组成和结构,(一）分子组成：,蛋白质的含氮量平均为16。,体内含氮物质以蛋白质为主，测定生物样品含氮量，可根据以下公式推算蛋白质大致含量：,100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数 6.25100,1/16%,蛋白质元素组成的特点：,蛋白质分类：,根据蛋白质组成成分分类：,结合蛋白质及其辅基,根据蛋白质形状
9、，可分为：,根据蛋白质结构与功能的关系：功能相似、结构相似（结构域、模体）、序列相似,根据同源蛋白质序列相似程度分类同源蛋白：来自同一祖先（功能相似）的蛋白 质，氨基酸序列相似程度25%。,（二）蛋白质的分子结构,蛋白质分子由氨基酸构成一条多肽链，分子量大，能折叠成一定的形状，形成具有空间结构的大分子。蛋白质的分子结构：蛋白质分子各原子的空间排布和相互关系。,一级结构：氨基酸的排列顺序，线性结构。二级结构：主链原子的空间排布。三级结构：主链和侧链原子的空间排布。一条多肽链所有原子的空间排布。四级结构：多条肽链之间原子的空间排布。,O O O O NH2-CH-CNH-CH-CNH-CH-C-N
10、H-CH-C-R R R R,1951年Linus Pauling等提出蛋白质螺旋结构1952年丹麦科学家(Linderstrom-Lang)建议：,三、蛋白质的一级结构 由氨基酸残基的排列顺序决定,蛋白质一级结构：(primary structure)指蛋白质分子，从N端到C端的氨基酸残基排列顺序。形成一级结构的化学键：肽键（主要化学键）、二硫键,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础，但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。细胞的环境因素影响蛋白质分子的空间构象。,目 录,蛋白质数据库,Genebank：NCBI网站：National Center for Biotechnology
11、Information http:/,四、蛋白质的二级结构 多肽链主链局部特殊构象,蛋白质二级结构：(secondary structure)蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构；即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。主链骨架原子：N-H、C、C=O重复排列。,O O O O NH2-CH-CNH-CH-CNH-CH-C-NH-CH-C-OH R R R R,（一）肽键是一个刚性的平面（肽键平面）,键长：CN：0.149 C=N：0.127 肽键：0.132肽键具有部分双键性质,O O CC NC CC=N+C H H,肽键平面：参与肽键的6个原子C1、C、O、N
12、、H、C2位于同一平面，此一平面称之。,肽单元：肽键平面的6个原子构成的单元结构称之。C1和C2在平面上所处的位置为反式构型。,H O R2 H H O R4 NH2CC=NCC=N CC=NCC R1 H H O R3 H H O,-螺旋(-helix)-折叠(-pleated sheet)-转角(-turn)无规卷曲(random coil),（二）蛋白质二级结构的主要形式：,维系二级结构的主要化学键：氢键,肽键平面通过C旋转或折叠形成的主链结构。,1、-螺旋是常见的蛋白质二级结构,-螺旋：多肽链肽键平面通过C旋转，形成一种螺旋的结构。,结构特点:,右手螺旋，R基团伸向螺旋的外侧。旋转一圈
13、:3.6个氨基酸残基，螺距0.54nm。螺旋稳定因素:每个肽链的C=O,与第4个氨基酸残基的N-H形成氢键。两性特点：每隔34个aa有1个极性或非极性aa，肽链具有亲水性或疏水性。,2、-折叠使多肽链形成片层结构,-折叠：多肽链肽键平面通过C折叠，形成一种伸展形的折纸状结构。,结构特点：,折纸状结构：以C为转折点，R基团在 折纸状结构的上下方。稳定因素：两条肽链或一条肽链两段之间 的C=O 与N-H 形成氢键。两段肽链走向：平行：N端到C端同方向，肽链间距0.65nm；反平行:N端到C端不同方向,肽链间距0.70nm。蛋白质的二级结构主要以螺旋和-折叠为主，许多蛋白质既有螺旋又有-折叠。,3、
14、-转角,-转角：肽链1800回折，回折角形成的结构。,4、无规卷曲：没有确定规律性的部分肽链结构。,结构特点：4个氨基酸残基组成，第1个残基的C=0 与第4个残基的N-H形成氢键。第二个残基常为Pro.,（三）模体是蛋白质的超二级结构,超二级结构：2个或2个以上具有二级结构的肽段相互接近、相互作用形成有规则的二级结构组合，称为超二级结构。常见的超二级结构：、,模体(motif)：具有特定潜在功能作用的超二级结构。蛋白质分子中，二个或三个具有二级结构的肽段，相互接近形成一个特殊的空间结构，并发挥专一的功能。,常见的模体结构：螺旋-环-螺旋锌指结构亮氨酸拉链结构。,钙结合蛋白的模体（螺旋-环-螺旋
15、）在环(无规卷曲)中亲水侧链的氧原子通过氢键与Ca2+结合。,钙结合蛋白中结合钙离子的模体,锌指结构,DNA结合蛋白的模体（锌指结构）1个螺旋，两个反平行-折叠组成，形似手指。N-末端1对Cys，C-末端1对His，容纳结合一个Zn2+。螺旋能镶嵌于DNA的大沟中，与DNA结合。,（四）氨基酸残基侧链对二级结构形成的影响,R基团电荷影响螺旋的形成：酸或碱性氨基酸集中的区域，同性相斥，不利螺旋。R基团大小影响螺旋的形成：（Phe、Try、Ile）集中的区域，不利螺旋。Gly，Pro不能形成典型的螺旋。折叠的氨基酸R基团较小。,五、蛋白质三级结构：多肽链在二级结构基础上进一步折叠形成,（一）三级结
16、构是指整条多肽链的空间分布,三级结构：整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。包括主链和侧链原子。具有功能作用的完整蛋白质分子。,主要化学键：非共价键疏水键、离子键、氢键和 Van der Waals力。以疏水键为主要作用，不牢固，易被破坏。,肌红蛋白(Mb)的三级结构,Mb的结构特点：153个氨基酸残基组成球状单链蛋白分子。8个螺旋占75%，间隔无规卷曲。含1个血红素辅基,（二）三级结构可含有功能各异的结构域,磷酸甘油醛脱氢酶的NAD+结合结构域和催化结构域,结构域：蛋白质分子折叠形成，相对致密的，具有一定功能作用的局部区域，称为结构域。结构域是蛋白质的
17、活性部位，是蛋白质局部肽链所有原子排布。,纤连蛋白分子的结构域,(四)根据结构域可对蛋白质进行分类,根据结构域可将球状蛋白质分为4类：反平行螺旋结构域（全-结构）平行或混合型折叠片结构域（，-结构）反平行折叠片结构域(全-结构)富含金属或二硫键结构域（不规则小蛋白质结构）,A.全-结构域 B.平行或混合型折叠片结构域C.全-结构域 D.富含二硫键结构域,（五）分子伴侣参与蛋白质的折叠,分子伴侣(chaperone)：能为其它蛋白质分子提供合适 环境，使之折叠成具有天然构象蛋白质的分子。本质：蛋白质：热休克蛋白、伴侣分子、核质蛋白。,作用：分子伴侣能与未折叠肽段疏水部分可逆反复结合，防止错误聚集
18、发生，使肽链正确折叠。分子伴侣能与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。分子伴侣能使二硫键形成正确的配对。,伴侣蛋白在蛋白质折叠中的作用,六、蛋白质的四级结构,四级结构：两条或两条以上具有独立三级结构的多肽链之间的空间排布及相互接触部位的布局和相互作用。亚基（subunit)：具有独立三级结构的多肽链。（蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用。）稳定因素：非共价键，疏水键为主。形式：均一四级结构：相同亚基组成。同聚体 非均一四级结构：不相同亚基组成。异聚体,血红蛋白的四级结构,（二）亚基通过亚基间的相互作用联系在一起,（三）生物体内有很多由多亚基组成的蛋白质,胰
19、岛素受体：4个亚基组成(22)，亚基与亚基形成单体(monomer)，2个单体形成二聚体(dimer)。,血红蛋白的一、二、三、四级结构,一级结构：氨基酸的排列顺序，线性结构。二级结构：主链原子的局部空间排布。超二级结构:几个二级结构的组合 模体:具有功能作用的超二级结构 结构域:局部主链和侧链原子的空间排布三级结构：主链和侧链原子的空间排布。一条多肽链所有原子的空间排布。四级结构：多条肽链之间原子的空间排布。,蛋白质结构与功能的关系Structure and Function of Proteins,第三节,（一）一级结构是空间构象的基础,一、蛋白质一级结构与功能的关系,天然状态，有催化活性
20、,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,（二）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能,一级结构相似的多肽或蛋白质，其空间构象以及功能也相似。（胰岛素）,氨基酸残基序号 胰岛素 A5 A6 A10 B30 人 Thr Ser Ile Thr 猪 Thr Ser Ile Ala 狗 Thr Ser Ile Ala 兔 Thr Gly Ile Ser 牛 Ala Gly Val Ala 羊 Ala Ser Val Ala 马 Thr Ser Ile Ala,哺乳动物胰岛素氨基酸序列的差异,促肾上腺皮质激素(ACTH)和促黑激素(-MSH,-MSH)共有一段相同的氨基酸序列
21、，因此，ACTH也可促进皮下黑色素生成但作用较弱。,(三)氨基酸序列提供重要的生物化学信息,一级结构与物种进化间存在关系。同源蛋白的氨基酸序列相似性程度与功能相关。,细胞色素c一级结构与生物进化物种进化越接近的生物，细胞色素一级结构越相似,（四）重要蛋白质氨基酸序列的改变可引起疾病,一级结构影响空间结构，影响蛋白质功能例：镰刀形红细胞贫血:glu:GTA val:GAA,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。,HbS 产生粘性位点，相互结合成纤维状沉淀。,二、蛋白质空间结构与功能的关系,（一）蛋白质功能需要完整的空间结构。单亚基蛋白质(单聚体):结构域没有完整的功能。多亚基蛋白
22、质(寡聚体):三级结构没有完整功能。（二）空间结构改变(变构),功能改变。（三）空间结构破坏(变性),功能丧失。,1.肌红蛋白/血红蛋白含有血红素辅基,血红素结构：铁卟啉化合物4个吡咯环，4个甲炔基Fe2+形成 6个配位键：4N、组aa、O22个CH2CH2COO-与aa连接,(一)血红蛋白构象与功能,肌红蛋白(myoglobin，Mb),单链蛋白质，8段-螺旋结构。血红素2个丙酸侧链负电荷与肽链两个碱性氨基酸侧链的正电荷结合；肽链F8组氨酸残基与Fe2+形成配位结合。,血红蛋白(hemoglobin，Hb),由4个亚基组成。各亚基的三级结构与Mb极为相似。Hb亚基之间通过8对盐键，使4个亚基
23、紧密结合。,氧合Hb：Hb（Mb）与O2结合后的Hb（Mb）。百分饱和度：氧合Hb(Mb)占总Hb(Mb)的百分数。氧解离曲线：氧分压与氧百分数的关系曲线。,2.血红蛋白的构象变化与结合氧的功能,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,Mb:呈直角双曲线 MB易与O2结合 Hb:呈S状曲线 O2分压低时：Hb不易与O2结合；O2分压升高：逐渐增强结合力。,Hb4个亚基通过8对盐键结合，形成紧密型（T态）结构，T态Hb与O2亲合力底。当第1个亚基与O2结合，盐键断裂，Hb转变为松弛型（R态)，R态亲合力提高,协同效应(cooperativity),一个多聚体蛋白质的一个亚基与配体结合，能
24、影响此多聚体的另一个亚基与配体结合，这种现象称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应(positive cooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应(negative cooperativity),Hb的第一个亚基与O2结合，促进第二个亚基与O2结合。,血红素与O2结合后，铁原子半径变小，进入卟啉环的小孔中，肽链位置变动,影响其它亚基的构象,使其它亚基结合O2能力增强。,别构效应(allosteric effect),蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为别构效应（变构效应）。,别构效应是协同效应的机制。,（二）蛋白质构象改变与构象病,蛋白质构象疾病：蛋白质构象发生改变，
25、影响蛋白质功能，所导致的疾病，称之。蛋白质的折叠发生错误，一级结构不变。,人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。,蛋白质构象改变导致疾病的机制：蛋白质错误折叠后相互聚集，聚集蛋白抵抗蛋白水解酶，产生淀粉样纤维沉淀，而致病。病理改变：蛋白质淀粉样纤维沉淀,老年痴呆症,疯牛病：由朊病毒蛋白(prion protein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。朊病毒蛋白的分型：正常细胞型PrP：PrPc 异常致病型PrP：PrPsc 朊病毒蛋白的特点：同一基因编码，氨基酸顺序和共价修饰相同。PrPc：螺旋构成、蛋白酶敏感型 PrPsc：折叠构成、抗蛋白酶消化型。,疯牛病中的蛋白质
26、构象改变,PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,以外源或新生的PrPsc为模板，使PrPc转变为PrPsc。PrPsc经蛋白酶消化后剩下的核心部分分子量约2730KD(PrP2730)仍具感染性。,第四节,蛋白质的理化性质Chemical and Physical Properties of Proteins,一、蛋白质具有两性电离性质,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的
27、pH称为蛋白质的等电点。,蛋白质的等电点(isoelectric point,pI),PHPI,利用电荷性质差异进行蛋白质分离,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：常用于蛋白质分子量的测定。等电聚焦电泳：通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。双向凝胶电泳：蛋白质组学研究的重要技术。,几种重要的蛋白质凝胶电泳：,二、蛋白质具有胶体性质,蛋白质分子量1万至100万之间，分子的直径1100nm，为胶粒范围之内。,蛋白质胶体稳定的因
28、素:水化膜：表面极性基团吸附H2O分子。颗粒表面电荷：静电斥力，使蛋白质颗粒不易聚集。,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,蛋白质沉淀：蛋白质胶体性质破坏，或疏水基团暴露，使蛋白质分子聚集，而从溶液中析出的现象。使蛋白质沉淀的因素：中和电荷：pH=pI 破坏水化膜：脱水剂 结构改变，疏水基团暴露。破坏空间结构：蛋白质变性,三、很多因素可引起蛋白质变性,在物理和化学因素作用下，蛋白质特定空间构象被破坏，即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物学活性的丧失。,蛋白质变性(denaturation),引起变性的因素：加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等,变性的本
29、质：破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。,变性的结果：理化性质改变：溶解度降低，粘度提高。生物学功能丧失，称为失活。,应用举例:使蛋白质变性：临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。防止蛋白质变性：有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。,蛋白质的复性(renaturation),天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,变性的蛋白质易于沉淀：蛋白质变性能使疏水侧链暴露，水化膜破坏，调节pH，蛋白质容易从溶液中沉淀。沉淀的蛋白质并不都变性。,蛋白质
30、变性与沉淀,四、蛋白质在紫外光谱区有特征性吸收峰,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,五、蛋白质呈色反应,（一）蛋白质经水解后产生茚三酮反应,蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应(ninhydrin reaction)。,（二）肽链中的肽键可与双缩脲试剂反应,蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应(biuret reaction)。双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,蛋白质的分离、纯化与序列分析Isolation,Purific
31、ation and Sequencing of Proteins,第五节,一、透析及超滤法:清除蛋白质溶液中的小分子化合物。二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀:常用的蛋白质沉淀方法三、利用电荷性质:可将蛋白质采用电泳法进行分离四、应用相分配或亲和原理:可将蛋白质进行层析分离五、利用蛋白质颗粒沉降:行为不同可进行超速离心分离,六、用化学或反向遗传学方法可分析或演绎多肽链的氨基酸序列,蛋白质氨基酸残基组成分析（离子交换层析）,蛋白质氨基末端与羧基末端测定,蛋白质水解肽链片段,测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法,一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终
32、得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。,氨基酸和肽的末端测定法,通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列：,按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,测定蛋白质末端氨基酸序列,测定cDNA序列,排列出mRNA序列,根据末端氨基酸序列设计RT-PCR引物,RT-PCR扩增cDNA,七、应用物理学、生物信息学原理可进行蛋白质空间结构测定或预测,圆二色光谱(circular dichroism，CD):测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。-螺旋：222nm、208nm处的负峰 198nm处的正峰；-折叠：CD谱不很固定。,二级结构测定,三级结构测定：X射线衍射法(X-ray diffraction)核磁共振技术(n
33、uclear magnetic resonance,NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。,根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构：几十万蛋白质序列 7000 X射线衍射法、NMR,同源模建：待研究的序列与已知结构的同源蛋白进行序列比对，通过模建和能量优化计算，产生目标序列三维结构。序列相似性越高，预测的模型也越准确。折叠识别：通过预测二级结构、预测折叠方式和参考其它蛋白的空间结构，从而产生目标序列的三维结构。从无到有：根据单个氨基酸形成二级结构的倾向，加上各种作用力力场信息，直接产生目标序列三维结构。,根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构：,目的与要求,掌握：氨基酸侧链的结构特
34、点；蛋白质的分子组成、分子结构形式和特点、理化性质。熟悉：蛋白质的一级结构、空间结构与 功能的关系；了解：蛋白质的分离、纯化与序列分析技术。（结合实验课学习）,一、透析及超滤法可清除蛋白质溶液中的小分子化合物,利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,超滤法,透析(dialysis),二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀是常用的蛋白质沉淀方法,使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,盐析(salt precip
35、itation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。,免疫沉淀法（immunoprecipitation）,三、利用电荷性质可将蛋白质采用电泳法进行分离,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,SDS-聚丙烯
36、酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。双向凝胶电泳，蛋白质组学研究的重要技术。,几种重要的蛋白质电泳：,四、应用相分配或亲和原理可将蛋白质进行层析分离,待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。,层析(chromatography),离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。,蛋白质分离常用的层析方法,五、利用蛋白质颗粒沉降行为不同可进行超速离心分离,超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。,蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient,S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。,因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。,S,
