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1、第五章 蛋白质工程与食品工业,概述,蛋白质是对生命至关重要的一类生物大分子，各种生命功能、生命现象、生命活动都和蛋白质有关。在生命有机体催化、运动、结构、识别和调节等许多方面，起着关键的作用。,主要内容,第一节 蛋白质的功能与结构,主要内容,一、蛋白质的功能,(1)蛋白质是构成生命的重要物质之一蛋白质是一类重要而复杂的生物大分子，它广泛地存在于所有生物界的机体之中，具有许多重要的作用；构成生物体新陈代谢的几乎全部的化学反应都是在活性蛋白质-酶的催化下进行的；高等动物的免疫反应，也主要是通过蛋白质即抗原和抗体来完成的；运动时的肌肉收缩靠的是某些蛋白质的相互作用来完成的；运输氧和二氧化碳的是血红蛋
2、白；具有代谢和调节功能的是多种蛋白质激素。,一、蛋白质的功能,(2)蛋白质的应用蛋白质是人类赖以维持生命的重要营养来源之一。人们需要从各种肉、蛋、奶、豆类等主要食品中获得所需的蛋白质营养。用蛋白质诊断和治疗某些疾病。淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶用于帮助消化，治疗某些消化不良性疾病；胰岛素用于治疗严重的糖尿病；转氨酶作为肝病变的指标等。食品工业和轻工业中主要应用蛋白质或利用蛋白质的性质制造各种产品。例如，酿造业要用蛋白酶来增加酱油的鲜味等。用于人类衣着的羊毛、纺织品和皮革主要组成是蛋白质。,二、蛋白质的结构,氨基酸是蛋白质的基本结构单位氨基酸的基本结构：,二、蛋白质的结构,各种氨基酸之间通过肽键彼此按
3、直线形头尾相连，构成不同长短的肽链。肽键就是由氨基酸的-羧基与相邻的氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键,肽键的形成,肽键的形成,二、蛋白质的结构,肽:氨基酸通过肽键连结起来的化合物二肽:两个氨基酸形成的肽三肽:三个氨基酸形成的肽多肽:许多氨基酸形成的肽蛋白质:大多为100个以上氨基酸组成的多肽,二、蛋白质的结构,多肽链的折叠可分为四种不同层次的结构。一级结构：仅指肽链中的氨基酸线型排列顺序，不考虑空间的排列。,牛胰岛素的氨基酸序列,二、蛋白质的结构,二级结构：主链原子的局部空间排列，不包括侧链构象和与其他链段的相互关系，如-螺旋、-折叠等主链构象单元就是二级结构。主要形式：-螺旋、-折叠、-
4、转角、无规卷曲等,二、蛋白质的结构,二、蛋白质的结构,-转角,二、蛋白质的结构,三级结构：蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲或折叠形成具有一定规律的三维空间结构。,碳酸酐酶的多肽骨架示意图,二、蛋白质的结构,四级结构：具有二条或二条以上独立三级结构的多肽链组成的蛋白质，其多肽链间通过次级键相互组合而形成的空间结构。,血红蛋白的结构,二、蛋白质的结构,（1）氢键：氢原子与负电性强的原子（如氧、氮等）间形成。对蛋白质分子三维构象的维护很重要。（2）静电引力：正负带电基团之间的吸引力。对蛋白质分子三维构象的稳定贡献不是很大，也称为离子键或盐键（3）范德华力：原子团相互接近时诱导所致。它
5、变化多样，对维持蛋白质活性中心的构象影响很大,二、蛋白质的结构,（4）疏水相互作用：是非极性基团为了避开水相而群集在一起的作用力。疏水作用是维持蛋白质高级结构的重要因素（5）二硫键：作用很强，对稳定蛋白质构象起重要作用 氢键、离子键、疏水作用和范德华力等次级键是非共价键 肽键、二硫键、酯键等被称之为共价键,第二节 蛋白质工程的诞生,蛋白质工程的诞生,1983年，美国生物学家额尔默首先提出了“蛋白质工程”的概念。蛋白质工程的实践依据DNA指导合成蛋白质，因此，人们可以根据需要对负责编码某种蛋白质的基因进行重新设计，使合成出来的蛋白质的结构变得符合人们的要求。,蛋白质工程的诞生,蛋白质工程就是以蛋
6、白质的结构与功能为基础，利用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至创造新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。蛋白质工程是指通过生物技术手段对蛋白质的分子结构或者对编码蛋白质的基因进行改造，以便获的更适合人类需要的蛋白质产品的技术。,蛋白质工程的诞生,蛋白质工程是指通过蛋白质化学、蛋白质晶体学和动力学的研究，获取有关蛋白质物理和化学等各方面的信息，在此基础上利用生物技术手段对蛋白质的DNA编码序列进行有目的的改造并分离、纯化蛋白质，从而获取自然界没有的、具有优良性质或适用于工业生产条件的全新蛋白质的过程。,蛋白质工程的诞生,蛋白质工程主要包括4大类研究：第一
7、利用已知的蛋白质一级结构的信息开发应用研究。第二定量确定蛋白质结构-功能关系。这是目前蛋白质工程研究的主体，它包括蛋白质三维结构模型的建立，酶催化的性质、蛋白质折叠和稳定性研究等.第三，从混杂变异体库中筛选具有特定结构-功能关系的蛋白质。第四，根据已知结构-功能关系的蛋白质，用人工方法合成它及其变异体.,第三节 蛋白质工程的基本步骤和保护方法,主要内容,蛋白质工程研究的主要步骤,分离纯化目的蛋白，使之结晶并作X晶体衍射分析，结合核磁共振等其他方法的分析结果，得到其空间结构的尽可能多的信息。对目的蛋白的功能作详尽的研究，确定它的功能域。通过对蛋白质的一级结构、空间结构和功能之间的相互关系的分析，
8、找出关键的基团和结构。,蛋白质工程研究的主要步骤,在蛋白质结构与功能研究的基础上，借助于计算机图像显示和分子辅助设计，提出对目的蛋白分子的改建或构建方案，并用基因工程的方法去实施。对经过改造的蛋白质进行功能性测定，看看改造的效果如何。,蛋白质工程的改造方法,在基因水平上对蛋白质进行改造，按改造的规模和程度可以分为：初级改造：个别氨基酸的改变和一整段氨基酸序列的删除、置换或插入高级改造：蛋白质分子的剪裁，如结构域的拼接从头设计合成新型蛋白质,蛋白质工程的改造方法,初级改造：通过基因突变方法，以达到改变氨基酸进而改造蛋白质的目的。目前，主要采用的基因突变方法：基因定位突变 盒式突变,蛋白质工程的改
9、造方法初级改造,基因定位突变的基本过程：首先使目的基因由环状载体折成单链，再对指定的位点用寡聚核苷酸诱导或置入合成的寡聚核苷酸产生定位突变基因，最后将突变基因导入适宜的表达系统(如大肠杆菌等)即可产生突变体蛋白质。这是目前定向改造蛋白质的基本手段。,蛋白质工程的改造方法初级改造,M13-DNA寡聚核苷酸介导诱变技术,将要改造的蛋白质的目的基因插入到M13单链DNA中,将杂合DNA双链再转入大肠杆菌中,将含突变目的基因的M13噬菌体筛选出来，提取它们的DNA，用限制性内切酶把突变目的基因切下，并重组到表达质粒中,作为模板，以含有要改变的碱基的一段寡聚核苷酸作为引物，在体外用DNA聚合酶进行双链D
10、NA的合成，用DNA连接酶连接成环状,蛋白质工程的改造方法初级改造,M13-DNA 寡聚核苷酸 介导诱变技术,蛋白质工程的改造方法初级改造,盒式突变的基本过程,蛋白质工程的改造方法初级改造,盒式突变,蛋白质工程的改造方法高级改造,高级改造：蛋白质分子的剪裁，如结构域的拼接结构域是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的一个层次。在较大的蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，形成二个或多个在空间上可以明显区别它与蛋白质亚基结构的区别。结构域拼接是通过基因操作把位于两种不同蛋白质上的几个结构域连接在一起，形成融合蛋白，它兼有原来两种蛋白的性质。,蛋白质工程的改造方法高级改造,用计算机分子
11、模型软件对金属硫蛋白的空间结构进行分析表明，天然金属硫蛋白的两个结构域之间具有较大的独立性，是可以拆分和构建的，因而构建结构域的“二倍体”的设想是可行的。用化学合成的方法分别合成结构域和连接肽段的基因，并设法将它们拼接起来。再插入载体并转入植物细胞中，使金属硫蛋白的结构域多倍体基因在植物中表达。,蛋白质工程的改造方法高级改造,蛋白质工程的改造方法合成新型蛋白质,基于天然蛋白质结构改造的蛋白质工程可以优化蛋白质的活性，而全新蛋白质设计是合成具有新奇的结构与功能的新蛋白质。,蛋白质工程的改造方法合成新型蛋白质,从头设计一个蛋白质的基本步骤：（1）从已知三维结构的数据库中挑选出一个合适的片段，进行修
12、改和组合（2）构建一个多肽链骨架模型（3）依据氨基酸残基的统计学数据和排列的优先顺序，确定每个残基位置上的氨基酸（4）优化目标蛋白的三维模型（5）检验和考核所给定的目标蛋白质结构是否合理，对所设计的模型做进一步修正（6）几轮的设计、检验和再设计，获得一个正确折叠和带有人们预期功能的目标蛋白质,第四节 蛋白质工程在食品产业中的应用,蛋白质工程在食品产业中的应用,在实际生产中，可以应用蛋白质工程对一些生产中重要酶或蛋白质性质加以改造，提高现有酶或蛋白质的工业实用性，如提高酶的热稳定性、改变酶的最适pH值条件、提高酶的催化活性等。例如，通过引入二硫键，改善酶的热稳定性。,蛋白质工程在食品产业中的应用
13、,蛋白质工程自问世以来，短短十几年的时间，已取得了引人瞩目的进展，在医学和工业用酶方面也获得了良好的应用前景。,提高蛋白的稳定性包括以下几个方面：,延长酶的半衰期,提高酶的热稳定性,延长药用蛋白的保存期,抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失,蛋白质工程在食品产业中的应用,蛋白质工程在食品产业中的应用,引入二硫键，改善蛋白质的热稳定性 溶菌酶分子：由一条肽链构成，并在空间上折叠形成二个相对独立的结构域，酶活性中心位于二个结构域之间。该酶分子在第97位和54位残基上是两个未形成二硫键的半胱氨酸由于二硫键是一种稳定蛋白质分子空间结构的重要共价化学键，有如建筑所用的钢筋一样，因而能将分子中的不同部位牢
14、固地联结在一起。因此，提高酶热稳定性最常用的办法是在分子中增加一对或数对二硫键。,蛋白质工程在食品产业中的应用,转化氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性 在高温下Asn和Gln容易脱氨形成Asp和Glu，而导致蛋白质分子构象的改变，使蛋白质失去活性。对酿酒酵母的磷酸丙糖异构酶进行诱变改造。这种酶有两个相同的亚基，每个亚基含有2个Asn，由于它们都位于亚基之间的界面上，可能对酶的热稳定性起决定性作用。,蛋白质工程在食品产业中的应用,通过寡核苷酸介导的定向诱变技术，将第14位和第78位上的2个Asn分别转变成Thr(苏氨酸)和Ile(异亮氨酸)残基，大幅度提高突变酶的热稳定性。,蛋白质工程在食品产业中的应用,牛胰岛素的合成,我国人工合成的牛胰岛素结晶,我国人工合成的牛胰岛素结晶,Thank you,
