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1、第三章 蛋白质工程及其在食品工业中的应用,概述,蛋白质是对生命至关重要的一类生物大分子物质，各种生命功能、生命现象、生命活动都和蛋白质有关。在生命有机体催化、运动、结构、识别和调节等许多方面，起着关键的作用。,酶.几乎全都是蛋白质。肌肉收缩、精子移动、细胞分裂过程中的染色体移动.高等生物的有序生长和分化过程。抗体蛋白能识别和结合特异性的外源物质，使人体具备抵抗各种细菌、真菌和病毒的能力。由神经细胞膜蛋白构成的离子通道，负责神经冲动的形成和传导。血红蛋白具有结合和释放氧的能力，是血液中氧、二氧化碳和氢离子的携带者。另外，人体的毛发和指甲属于角蛋白，而血栓是由血纤蛋白单体聚合而成的。,蛋白质的生物
2、学功能,1.催化功能：酶2.调节功能：激素3.结构功能：皮、毛、骨、牙、细胞骨架4.运输功能：血红蛋白5.免疫功能：免疫球蛋白6.运动功能：鞭毛、肌肉蛋白7.储藏功能：酪蛋白8.生物膜功能：及神经传导等,蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需要进行改造。由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋
3、白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。,蛋白质工程就是以蛋白质的结构与功能为基础，利用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至创造新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。,蛋白质工程的概念,1983年，美国生物学家额尔默首先提出了“蛋白质工程”的概念。蛋白质工程的实践依据DNA指导合成蛋白质，因此，人们可以根据需要对负责编码某种蛋白质的基因进行重新设计，使合成出来的蛋白质的结构变得符合人们的要求。,具体地说，蛋白质工程就是通过对蛋白质已知结构和功能的了解，借助计算机辅助设计，利用基因定点诱变等技术，特异性地对蛋白质结构基因进行改造，借以改
4、善蛋白质的物理和化学性质（热稳定性、酶的专一性），或利用化学和物理手段，对目标基因按预期设计进行修饰和改造，合成新的蛋白质。并由此深入研究蛋白质的结构与功能的关系。,蛋白质工程的概念,蛋白质工程蛋白质工程就是运用蛋白质结构功能和分子遗传学知识，从改变或合成基因入手，定向地改造天然蛋白质或设计制造新的蛋白质,三个步骤：1、获得目的蛋白质晶体，并利用X射线技术通过晶体衍射仪收集衍射数据，然后对晶体进行测量、分析，确定蛋白质的空间结构。2、借助计算机对蛋白质进行饰变，通过建立数据库和人工智能等途径确定蛋白质结构和功能的关系确定需要修饰的位点。,蛋白质工程的目标和研究过程,目标：根据人们的需要改造天然
5、蛋白质或设计创造自然界原来没有的全新蛋白质,三个步骤：3、运用定点突变技术等一系列基因操作技术手段来改变编码蛋白质的基因，从而实现对蛋白质的改变。对已经存在的蛋白质“下手”，从结构测定入手。创造全新的蛋白质，要根据已有的蛋白质结构和功能的信息资料进行分子设计-基因表达-对表达产物的结构和功能进行检测、分析。必经之路：（饰变、分析、检测、修改）*N,蛋白质工程的目标和研究过程,蛋白质工程是在深入理解目标蛋白质的“结构-功能”关系的基础上，进行严格的分子设计，定向改造一个预期的新特性的蛋白质。一般的两种情况：对天然的蛋白质进行改造。（已有的蛋白质）完全重建一个自然界原来没有的蛋白质。（全新的）对天
6、然的蛋白质操作有：少数几个AA残疾进行替换（小改）分子剪裁（中改）局部重建（大改）,重建一个自然界原来没有的蛋白质：从头设计一个全新的蛋白质 目前，蛋白质工程主要进行的是中改、小改。“大改”和“从头设计”，要求必须全面掌握蛋白质一级结构决定高级结构的规律，掌握高级结构与功能的相关性。现存的蛋白质数据库还满足不了对蛋白质空间结构的研究,实例1：玉米中赖氨酸的含量比较低,如果对赖氨酸合成过程中的两个关键酶进行改造,可以使玉米叶片和种子中的游离赖氨酸分别提高5倍和2倍。,原因：赖氨酸合成过程中两个关键酶天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的活性，受细胞内赖氨酸浓度的影响。当赖氨酸浓度达到一定量时，就会
7、抑制这两种酶的活性。,人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之后，生命科学乃至自然科学领域一项重大的科学命题。2001年，国际人类蛋白质组组织宣告成立。之后，该组织正式提出启动了两项重大国际合作行动：一项是由中国科学家牵头执行的“人类肝脏蛋白质组计划”；另一项是以美国科学家牵头执行的“人类血浆蛋白质组计划”，由此拉开了人类蛋白质组计划的帷幕。,“人类肝脏蛋白质组计划”是国际上第一个人类组织器官的蛋白质组计划，由我国贺福初院士牵头，这是中国科学家第一次领衔的重大国际科研协作计划，总部设在北京，目前有16个国家和地区的80多个实验室报名参加。它的科学目标是揭示并确认肝脏的蛋白质，为重大肝病预防、诊断、
8、治疗和新药研发的突破提供重要的科学基础。人类蛋白质组计划的深入研究将是对蛋白质工程的有力推动和理论支持。,思考：对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？,应该从对基因的操作来实现对天然蛋白质改造，主要原因如下：（1）任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的。（2）对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易操作，难度要小得多。,二、蛋白质工程的基本原理,1、蛋白质工程的目标,根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分
9、子设计。,2、天然蛋白质的合成过程,基因表达（转录和翻译）形成氨基酸序列的多肽链形成具有高级结构的蛋白质行使生物功能,中心法则（central dogma）,生物的遗传信息从 DNA传递给mRNA的过程称为转录。根据mRNA链上的遗传信息合成蛋白质的过程，被称为翻译和表达。1958年Crick将生物遗传信息的这种传递方式称为中心法则。,中心法则：遗传信息由DNA mRNA 蛋白质的流动途径。,补充和完善之处：A：RNA作为遗传物质能自我复制，并作为mRNA指导PRO的合成。B：RNA能以逆转录的方式将遗传信息传递给DNA分子。,复制：是亲代双链DNA按碱基配对原则，准确形成两个相同核苷酸序列的
10、子代DNA分子的过程。两条DNA链都可作为复制的模板。转录：是以一条DNA链为模板，将DNA链上储存的遗传信息按碱基配对原则准确转换成互补的mRNA的过程。翻译：是以mRNA为模板，将mRNA上的遗传信息转换成蛋白质的氨基酸序列的过程。中心法则：遗传信息由DNA mRNA 蛋白质的流动途径。,、蛋白质工程的基本途径,预期的蛋白质功能,设计预期的蛋白质结构,推测应有的氨基酸序列,找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）,讨论：某多肽链的一段氨基酸序列是：丙氨酸色氨酸赖氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸,（1）怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？请把相应的碱基序列写出来。,首先应该根据三联密码子推出mRNA序列，
11、每种氨基酸都有对应的三联密码子，只要查一下遗传密码子表，就可以将上述氨基酸序列的编码序列查出来。再根据碱基互补配对规律推出脱氧核苷酸序列。但是由于上述氨基酸序列中有几个氨基酸是由多个三联密码子编码，因此其碱基排列组合起来就比较复杂，至少可以排列出16种。,密码子：,mRNA上决定一个氨基酸的三个相邻碱基,密码子总数：43=64种(其中61种密码子是对应氨基酸 和起始；另有3个不对应氨基酸，只对应终止),1种密码子只对应1种氨基酸；1种氨基酸可以对应多种密码子。,密码子在生物界基本是通用的。这也是生物彼此间存在亲缘关系的证据之一。,GCU（或C或A或G）UGGAAA（或G）AUGUUU（或C）,
12、mRNA序列,脱氧核苷酸序列,（2）确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因（DNA）？,确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类的需要改造它，通过人工合成的方法或从基因库中获取。,4、蛋白质工程与基因工程的关系,蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。,基因工程是通过基因操作把外源基因转入适当的生物体内，并在其中进行表达，它的产品是该基因编码的天然存在的蛋白质。,蛋白质工程就是根据蛋白质的精细结构与功能之间的关系，利用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至创造新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分
13、子。蛋白质工程自诞生之日起，就与基因工程密不可分。蛋白质工程根据对分子预先设计的方案，通过对天然蛋白质的基因进行改造，来实现对它所编码的蛋白质进行改造。因此，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改造的、具有了人类所需要的优点的蛋白质。,5 蛋白质工程与酶工程的关系,绝大多数酶都是蛋白质，酶工程与蛋白质工程有什么区别？酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。概括地说，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面组成的。酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中。,通常所说的酶工程是用工程菌生产酶制剂，而没有经过由酶的功能
14、来设计酶的分子结构，然后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序列等步骤。因此，酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用，而蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。当然，随着蛋白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。,蛋白质分子的生物功能，与蛋白质分子的结构密不可分。决定蛋白质这种特殊生物功能的关键因素是它的分子构象。,蛋白质的结构,基本组成单位-氨基酸,组成生物体蛋白质的20种氨基酸,组成生物体蛋白质的20种氨基酸,肽（肽键与肽),肽键就是由氨基酸的-羧基与相邻的氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键,肽（肽键与肽),肽:氨基酸通过肽键连结起来的化合物二肽
15、:两个氨基酸形成的肽三肽:三个氨基酸形成的肽多肽:许多氨基酸形成的肽蛋白质:大多为100个以上氨基酸组成的多肽,氨基酸残基:多肽链中不完全的氨基酸。氨基酸由于形成肽键而失去了一分子水，因此表现出其分子的不完整。氨基末端：多肽链中含有自由-氨基的一端。简称N-端羧基末端：多肽链中含有自由-羧基的一端。简称C-端,蛋白质的一级结构 蛋白质的一级结构是指氨基酸按一定的顺序通过肽键相连而成的多肽链，也是蛋白质最基本的结构。每一种蛋白质分子都有自己特有的氨基酸的组成和排列顺序即一级结构，由这种氨基酸排列顺序决定它的特定的空间结构，也就是蛋白质的一级结构决定了蛋白质的二级、三级等高级结构。,蛋白质分子的一
16、级结构,牛胰岛素的一级结构,（1）氢键：氢原子与负电性强的原子（如氧、氮等）间形成。对蛋白质分子三维构象的维护很重要。（2）静电引力：正负带电基团之间的吸引力。对蛋白质分子三维构象的稳定贡献不是很大，也称为离子键或盐键（3）范德华力：原子团相互接近时诱导所致。它变化多样，对维持蛋白质活性中心的构象影响很大,维持蛋白质空间结构的化学键,（4）疏水相互作用：是非极性基团为了避开水相而群集在一起的作用力。疏水作用是维持蛋白质高级结构的重要因素（5）二硫键：作用很强，对稳定蛋白质构象起重要作用氢键、离子键、疏水作用和范德华力等次级键是非共价键肽键、二硫键、酯键等被称之为共价键,蛋白质二级结构 二级结构
17、是指多肽链借助于氢键沿一维方向排列成具有周期性结构的构象，是多肽链局部的空间结构（构象）主要形式：-螺旋、-折叠、-转角、无规卷曲等,-转角,蛋白质分子的二级结构,螺旋,折叠片,转角,自由回转,三级结构三级结构是指整条多肽链在二级结构的基础上进一步盘曲而成特定格式的三级结构。四级结构很多蛋白质分子是由两个或两个以上独立的、具有三级结构的多肽链组成的。这些多肽链之间只是通过疏水作用等次级键结合成为有序排列的特定的空间结构，形成了四级结构。在四级结构的蛋白质分子中，每个具有三级结构的多肽链单位称为亚基，亚基多无生物学活性，具有完整四级结构的蛋白质分子才有生物活性。,血红蛋白中四亚基两两相同，分别称
18、为1、2、1、2,蛋白质结构和功能的关系,1、蛋白质一级结构与功能的关系（1）相似的结构具有相似的功能。一级结构相似的多肽或蛋白质，其空间结构及功能也相似。催产素、抗利尿激素都是由下丘脑神经细胞合成的九肽类激素,前者具有催产及使乳腺(Phe的作用.如图为催产素结构简式,若将异亮氨酸(He)和亮氨酸(Leu)分别替换为苯丙氨酸和精氨酸则为抗利尿剂。催产素兼有抗利尿剂激素作用，抗利尿剂激素也兼有催产素的作用。,蛋白质结构和功能的关系,1、蛋白质一级结构与功能的关系（2）不同的结构具有不同的功能 尽管催产素、抗利尿激素有相似的功能，但它们的结构并不完全相同，因此生物学活性也有很大差异 催产素的催产功
19、能强于抗利尿剂激素。抗利尿剂激素的利尿作用远强于催产素。所以，一级结构发生改变，其功能必然改变。,蛋白质结构和功能的关系,2、蛋白质空间结构与功能的关系 蛋白质的空间结构是其生物活性的基础，空间结构发生改变，其功能也必然随之改变。核糖核酸酶，不破坏它的一级结构，只是破坏其氢键，二硫键还原为巯基，该酶也会失去活性。原因：二级、三级结构发生改变 恢复结构，酶的活性也可得到恢复。,食品蛋白的改性,人类迫切需求具有功能特性和营养特性的蛋白质 一方面，开发蛋白质资源（优质蛋白）。另一方面，对现有蛋白质进行改造-改性蛋白质。蛋白质的改性是指通过物理、化学和生物(酶)的方法改变蛋白质的结构，从而改善它们的功
20、能特性，使之达到食品所需要的品质特性，以扩大蛋白质在不同类型食品体系中的应用范围。实质：利用生化因素或物理因素切断蛋白质分子中的主链或是对蛋白质分子的侧链基团进行修饰，从 而引发蛋白质空间结构和理化性质的改变，获得具有功能特性和营养特性较好的蛋白质。,蛋白质改造方法,在基因水平上对蛋白质进行改造，按改造的规模和程度可以分为：小改：个别氨基酸的改变和一整段氨基酸序列的删除、置换或插入中改：蛋白质分子的剪裁，如结构域的拼接大改：局部重建从头设计合成新型蛋白质,一、小改造通过基因突变方法，以达到改变氨基酸进而改造蛋白质的目的。目前，主要采用的基因突变方法：基因定点突变盒式替换技术,基因定点突变根据三
21、联体密码，编码DNA（目的基因）的确定位点，改变其组成核苷酸的顺序或种类，使基因发生定向变异，使其控制合成的氨基酸种类、顺序发生改变，合成出具有预期氨基酸序列的修饰蛋白质。这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。,1985年Wells提出的一种基因修饰技术，可经过一次修饰，在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，从而可以对蛋白质分子中某些氨基酸进行“饱和性”分析。利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧造成两个原载体和基因上没有的内切酶切点，用该内切酶消化基因，再用合成的发生不同变化的双链DNA片段替代被消化的部分。这样一次处理就可以得到多种
22、突变型基因。,盒式突变技术,二、蛋白质分子的高级改造（结构域的拼接）,研究证明，在二级结构和三级结构之间还有一个结构层次，即结构域结构域由螺旋、折叠等二级结构单位按一定的拓扑学规则构成的三维结构实体。结构域是蛋白质分子中一种基本的结构单位，结构域拼接是通过基因操作把位于两种不同蛋白质上的几个结构域连接在一起，形成融合蛋白，它兼有原来两种蛋白的性质。,三、全新蛋白质的设计与构建,上述两种蛋白质改造方法，通常是从一个已知顺序、结构和功能的蛋白质出发，根据一定的目标和设计方案，使用多肽合成或者基因工程的方法，改变它的结构，以期达到改变其性质的目的。如果要从头设计和构建一个自然界不存在的蛋白质，则需要
23、借助多功能模板和蛋白质二级结构元件组装成某种具有特定功能的人工蛋白质分子。,蛋白质工程在食品工业中的应用,蛋白质工程自问世以来，短短十几年的时间，已取得了引人瞩目的进展，在医学和工业用酶方面也获得了良好的应用前景。,提高蛋白质的稳定性包括以下几个方面：延长酶的半衰期；提高酶的热稳定性；延长药用蛋白的保存期；抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。,一、消除酶的被抑制特性,1985年，美国的埃斯特尔借助寡核苷酸介导的定位突变技术，用19种其他氨基酸分别替代枯草芽孢杆菌蛋白酶分子第222位残基上易氧化的甲硫氨酸，获得了一系列活性差异很大的突变酶。发现除了用半胱氨酸代替甲硫氨酸的突变体以外，其他突变体
24、的酶活性都降低了。,二、引入二硫键，改善蛋白质的热稳定性,溶菌酶分子：由一条肽链构成，并在空间上折叠形成二个相对独立的结构域，酶活性中心位于二个结构域之间。该酶分子在第97位和54位残基上是两个未形成二硫键的半胱氨酸由于二硫键是一种稳定蛋白质分子空间结构的重要共价化学键，有如建筑所用的钢筋一样，因而能将分子中的不同部位牢固地联结在一起。因此，提高酶热稳定性最常用的办法是在分子中增加一对或数对二硫键。,在高温下天冬酰胺和谷氨酰胺容易脱氨形成天冬氨酸和谷氨酸，而导致蛋白质分子构象的改变，使蛋白质失去活性。对酿酒酵母的磷酸丙糖异构酶进行诱变改造。这种酶有两个相同的亚基，每个亚基含有2个天冬酰胺，由于
25、它们都位于亚基之间的界面上，可能对酶的热稳定性起决定性作用。通过寡核苷酸介导的定向诱变技术，将第14位和第78位上的2个天冬酰胺分别转变成Thr(苏氨酸)和Ile(异亮氨酸)残基，大幅度提高突变酶的热稳定性。,三、转化氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性,四、改变酶的最适pH值条件,葡萄糖异构酶最适pH为碱性，在80稳定，而在碱性条件下，80时使高果糖浆焦化产生有害物质，反应只能在60进行。采用盒式突变技术将葡萄糖异构酶分子中酸性氨基酸(Glu谷或Asp天冬)集中的区域置换为碱性氨基酸(Arg精或Lys赖)，可使葡萄糖异构酶的最适pH值变为酸性，即可在高温下进行反应,五、提高酶的催化活性,酶的催化活
26、性由酶分子上的必需基团决定如对酪氨酸-tRNA合成酶进行定点突变在天然状态下，酪氨酸-tRNA合成酶分子内第51位苏氨酸残基的羟基能与底物酪氨酰腺嘌呤核苷酸戊糖环上的氧原子形成氢键，这个氢键的存在影响酶分子与另一底物ATP的亲和力。因此，利用定向诱变技术将酶分子第51位苏氨酸残基改变为脯氨酸残基，酶(Pro-51)与ATP的亲和力被增加了近100倍，而且最大反应速度亦大幅度提高。,六、修饰酶的催化特异性 利用定点突变技术葡萄糖淀粉酶的催化特性。如将活性中心的GLu、Asp被Gln、Asn取代时，突变体酶分解-1，4糖苷键和-1，4糖苷键的活性比例发生明显改变,改变Nisin氨基酸的序列，可增强
27、其稳定性、溶解度和扩大抑菌谱等，扩大Nisin的应用范围。,Nisin分子结构中包含5种稀有氨基酸，即ABA、DHA、DHB、ALA-S-ALA和ALA-S-ABA，它们通过硫醚键形成五个内环。,七、修饰Nisin的生物防腐效应 Nisin是乳酸球菌分泌的有较强抗菌作用的小分子肽，可用于罐头食品、乳制品、肉制品的保藏Nisin由34个氨基酸残基构成,蛋白质在风味修饰蛋白方面的应用,1、物理改性2、化学改性（1）碱处理（2）酸处理（3）琥珀酰化作用（4）乙酰化作用（5）磷酸化作用（6）酰胺化作用（7）硫醇化作用（8）酯化作用（9）糖酰化作用（10）去酰胺基作用,3、酶法改性4、化学-酶改性作用5、化学改性及酶法改性限制因素（如何消除苦味？）,思 考 题1、什么是蛋白质工程?蛋白质工程基本步骤有哪些?2、蛋白质的改性修饰技术有哪些?3、如何消除酶水解蛋白质的苦味？,
