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1、,第十九章 补体检测及应用,第一节 概述 一、补体成分的含量与理化特性 二、补体的活化途径,第二节 补体总活性测定,第三节 单个补体成分的测定 一、免疫溶血法 二、免疫化学法,第四节 补体结合试验 一、试验原理 二、试验方法 三、方法评价,第五节 补体受体的测定 第六节 补体测定的应用,思考题 小结,第一节 概 述,补体：具酶样活性、不耐热的糖蛋白 其存在与抗原性异物的刺激无关 在正常人血清中含量相对稳定 某些疾病时，含量及其活性可发生改变,分 类,一、补体成分的含量与理化特性,根据补体系统的生物学功能，可将其分为：补体固有成分、补体调节蛋白、补体受体(complement receptor,
2、CR)三大部分。,补体理化性质,由肝细胞、巨噬细胞以及肠粘膜上皮细胞等多种细胞产生 均为多糖蛋白，大多数电泳迁移率属、球蛋白含量约占血清球蛋白总量的10%，其中C3含量最高、D因子含量最低固有成份间的分子量差异较大，其中C1q最大、D因子最小。对热不稳定，56C、30min即被灭活，010 C条件下活性只能保持34d。多种理化因素如射线、机械振荡、酒精、胆汁和某些添加剂等均可破坏补体,经典途径,二、补体的活化途径,三 种 途 径 比 较,第二节 补体总活性测定,补体总活性测定方法是以红细胞的溶解为指示，以50%溶血为判断终点，称为CH50补体活化途径不同，应用不同的激活物可活化不同的补体途径基
3、于经典途径的CP-CH50（临床常规项目）应用于C3旁路检测的AP-CH50（尚未列入检验常规）MBL途径活性测定的可靠方法暂未建立,（一）CH50测定法的原理,应用绵羊红细胞（sheep red blood cell,SRBC）和其相应的抗体（溶血素），作为能诱导补体活化经典途径的指示物和激活剂。补体能使溶血素特异性结合的绵羊红细胞溶解，当溶血素和绵羊红细胞浓度恒定时，溶血程度与补体含量和活性相关。将新鲜待检血清作不同稀释后，加入反应体系，测定溶血程度，以50%溶血时的最小血清用量作为判定终点，可测知补体总溶血活性,溶血程度与补体含量的关系,在适当、稳定的反应系统中，溶血反应与补体的剂量依赖
4、关系呈现“S”形曲线 在轻微溶血和接近完全溶血时，补体量的变化对溶血程度的影响不大，即溶血对补体量的依赖不敏感。但在3070%溶血时，补体含量仅出现较小的变动，溶血程度也会发生较大的改变,（二）CH50测定方法,1.红细胞浓度的调整,绵羊红细胞（SRBC）采自绵羊颈静脉，制备脱纤维羊血或用阿氏（Alsever）血液保存液制成抗凝血，4保存备用。使用前，调制成2%5%SRBC悬液。为使红细胞浓度标准化，可吸取少量红细胞悬液，加入2030倍的稀释液，在542nm波长处测定吸光值以调整红细胞浓度。,2.溶血素滴定,溶血素可通过SRBC免疫家兔获得，一般无需纯化试验前需先行加热56 30min或60
5、3min以灭活补体溶血素有商品销售，可按标识效价稀释使用自行制备的溶血素需进行滴定，确定使用浓度，在补体活性测定中，大多使用2个单位。溶血素效价稳定，一般使用3个月后再作重新滴定,3.稀释缓冲液 4.50%溶血标准管 5.50%溶血总补体值的计算,（三）方法评价与临床意义,方法简便、快速，但敏感性低，补体的活性除与反应体积成反比外，还与反应所用的缓冲液、SRBC的数量以及反应温度有关 总补体活性的参考范围为50100U/ml CH50增高见于：急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤等CH50降低见于：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎、急性肾小球肾炎等,第三节 单个补体成分的测定,常作为单个补
6、体成分的检测指标：C3、C4、C1q、B因子和C1酯酶抑制物等测定方法：免疫溶血法（检测单个补体成分的活性）免疫化学法（检测单个补体成分的含量）自动化免疫散射比浊法,一、免疫溶血法,定义:是根据补体参与抗体介导溶细胞作用的级联效应特征建立的单一补体成分检测法指示系统:以SRBC-抗SRBC为激活物和指示系统参照体系:以人为设计的缺乏某种补体成分的血清为参照结果判度:若有溶血发生，表明待检标本存在参照血清所缺乏的补体成分，且溶血程度与此补体成分的量呈正比，仍以50溶血为终点,参照血清常称之“R（remove）”试剂，即去除某种补体成分之意。已能筛选到的血清有人C2缺乏、豚鼠C4缺乏、小鼠C5缺乏
7、和家兔C6缺乏的血清 免疫溶血法常用于C2、C3、C4、C5、C6等补体成分的检测。其中以C3、C4两成分的检测更为常见,二、免疫化学法,免疫化学法分类 1.单向免疫扩散 2.火箭免疫电泳 3.透射比浊法 4.散射比浊法 前两种方法：手工操作繁琐、耗时长、影响因素多、结果重复性差，已趋于淘汰 后两种方法：通过仪器对补体的C3、C4、B因子等单个成分进行自动化测定,比浊法,比浊法原理 借助补体的抗原性和与相应抗体反应的前带现象建立的补体单个成分定量检测法。比浊法不足 必需以过量的某种补体相应抗体为保证 自动免疫比浊法 反映所测补体成分的绝对量 可进行标准化流程管理与质量控制,第四节 补体结合试验
8、,补体结合试验(complement fixation test，CFT)将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反应 系统中抗原或抗体的传统方法。,一、试验原理,作用原理：利用补体的溶细胞作用进行各种物理状态的抗原抗体测定,5种成分，3个系统反应系统：已知抗原（或抗体）与待测抗体（或抗原）补体系统指示系统：SRBC与相应溶血素。试验时常将其预先结合，成为致敏绵羊红细胞（sensitized sheep red blood cell,SRBCS）。,反应分两步进行 第一步:反应系统与补体的作用 第二步:指示系统利用剩余补体的反应,不溶血为补体结合试验阳性，而溶血为试验阴性,（一）.试剂的准备,二、
9、补体结合试验方法,1.抗原或抗体用于试验的抗原或抗体:需要纯化 纯度愈高，特异性愈强抗原与抗体比例适当:确定抗原或抗体相应的使用单位 采用方阵或棋盘法进行抗原与抗体滴定,由于该试验基于指示和试验两对抗原抗体系统竞争补体因此，补体必须恒量，且以满足指示系统的溶血为度，过多会导致假阴性，而过少则引起假阳性。,2.补体,采用豚鼠血清为补体 对补体进行滴定和确定其用量，以能产生完全溶血的最少补体用量为1个实用单位正式试验时使用2个实用单位补体的性质不稳定，每次试验前均应进行滴定,血清标本遇有抗补体现象时，可作下列处理：加热灭活时提高12 20冻融后离心去沉淀 以3mmol/L盐酸处理 加入少量补体后再
10、行灭活 以白陶土处理 通入CO2 以小白鼠肝粉处理 用含10新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释血清,3.待测标本,采血并及时分离血清用于检测或20保存备用。试验前，应先将血清56加热30min（或603min）以灭活补体。,（二）正式试验,分类:小量法、微量法，以小量法常用 实验过程:稀释和处理后的标本与已知抗原或抗体、不同含量的补体温育与指示系统共育结果判度:对照管:阴性对照管:溶血 阳性对照管:不溶血 抗体或抗原对照管:完全溶血 待检血清对照管:完全溶血 绵羊红细胞对照管:不出现自发性溶血,补体对照管：受检血清 阳性:不溶血 阴性:溶血注意:若上述各对照管不出现预期结果，则试验结果不可靠，其可能原因
11、应根据出错的对照管进行分析。,2个单位:全溶1个单位:全溶或略带少许红细胞 0.5个单位:不发生溶血,三、方法评价,优 点灵敏度高、所测定的抗体水平可达0.05g/ml，出现交叉反应的机率较小，可检测的抗原或抗体范围广泛，无需特殊设备、结果容易观察、试验条件要求不高现 状影响的因素多、各种制剂需要烦琐的稀释和滴定等，现代化、自动化抗原抗体检测方法的不断涌现，补体结合试验逐渐被遗弃补体结合试验作为一种经典的免疫方法类型，其设计和原理仍对新型免疫方法的建立有着启迪和指导作用,第五节 补体受体的测定,补体受体：存在于多种细胞 清除免疫复合物、净化机体内环境 检测补体受体，有助于判断机体抗感染能力和计
12、 数相应的细胞数量,补体受体,目前已知的补体受体归为以下五类：CR1（CD35）CR2（CD21）CR3（CD11b/CD18）CR4(gp150/95，CD11c/18)C3aR/C5aR,补体受体特性,第六节 补体测定的应用,补体相关试验：诊断梅毒螺旋体感染的华氏反应（已淘汰）HLA分型的补体依赖性细胞毒试验 抗原抗体检测的脂质体免疫试验、免疫粘连血凝试验 抗体形成细胞定量检测的溶血空白斑技术 免疫复合物测定的胶固素结合试验和C1q结合试验,应用于补体含量和活性检测的试验 AP-CH50和AP-H50试验:反映总补体活性 溶血试验 免疫化学试验 免疫荧光技术,检测补体单个成分及其裂解产物（
13、C1q、C3SP、C3、C4、B因子等）和补体受体,(图)血管神经性水肿,补体含量和活性相关的疾病,1免疫相关性疾病：如自身免疫性疾病时，C1、C2、C3、C4和Hf等缺陷；超敏反应时（III型超敏反应），C3a、C5a等过敏毒素的产生。2与补体有关的遗传性疾病：C2、C3缺陷导致的严重感染；与C1抑制物缺陷相关的遗传性血管神经性水肿 SLE患者出现的细胞表面CR1缺陷与C1C清除障碍 涉及I因子、H因子缺陷的肾小球肾炎；DAF缺陷引起的阵发性血红蛋白尿；C1q缺陷表现的严重顽固性皮肤损害，以及C1q、C1r、C4、C2缺陷造成的 免疫复合物性血管炎（包括肾炎）等。,(图)血管神经性水肿,3补
14、体含量显著降低的疾病：消耗增多:免疫复合物形成导致的补体活化和消耗增多.如SLE.补体的大量丢失:主要见于大面积烧伤、失血及肾脏病患者补体合成不足:常见于肝脏疾病患者或营养不良的病人。4高补体血症：偶见于感染恢复期和某些恶性肿瘤患者，正常妊娠时，也可观察到补体值的增高。,1.已知补体的活化有三条途径，试述三条激活途径有何不同？2.试述补体在抗感染免疫中有何作用？3.补体有30余种成分，各自的作用不同但相互联系，补体的网络系统中起关键作用的成分是哪几个？4.补体在参与机体免疫系统效应中发挥的主要作用是什么？5.应用补体检测抗原抗体的方法有几种？有无你认为可以建立但尚无人提及的？,思考题,6.补体
15、在参与人类疾病的病理损伤中发挥什么作用？7.机体的免疫损伤或炎症多发生于什么情况下？损伤的机制是什么？8.试比较各种补体检测方法的优缺点和如何进行临床应用选择？9.补体缺陷所表现的主要临床特征是什么？10.补体的主要理化特点是什么？,小结,补体是重要的参与固有免疫的可溶性球蛋白分子，同时有助于特异性抗体产生后效应的发挥，可有效地清除机体的可溶性免疫复合物，发挥彻底排除异物的功效。与此同时，也可通过清除抗原抗体反应形成于组织或细胞膜上的复合物，造成炎症损伤，参与疾病的形成过程。,补体清除可溶性免疫复合物，与补体的溶细胞作用和调理吞噬作用的发挥相关。,补体的检测，主要是根据补体的抗原性和溶细胞活性设计的。补体检测的方法涉及总补体活性的测定和单个补体成分的检测，其中总补体活性测定，在临床应用广泛者当数经典途径的CH50检测法；而单个补体成分检测则包括溶血法与免疫化学法，后者可用于定量测定。,
