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1、第四章 环境化学物的一般毒性及其评价,一、实验动物的选择 实验动物是指经人工培育，对其携带微生物实行控制，遗传背景明确，来源清楚，可用于科学研究的动物。,第一节 化学物毒性评价的实验基础,以选择哺乳动物为主。可采用23种，啮齿类和非啮齿类。常用大鼠(rat）、小鼠（mouse）、豚鼠、家兔和狗，尤以大鼠使用很多。,Wistar 大鼠,豚鼠,对化合物的毒性反应及代谢过程与人相似自然寿命不太长易于饲养和实验操作经济并易于获得,（一）物种选择 种类选择的依据：,（二）品系选择 品系指计划交配的办法获得的起源于共同祖先的一群动物。同一品系的动物具有共同的遗传来源、相似的外貌特征、独特的生物学特性及稳定
2、的遗传性能。,1、近交系动物 指采用连续20代以上兄妹交配或亲子交配而培育的纯品系动物。遗传上高度一致，基因纯合度可达98.6-99.8%。,对放射线耐受性强，淋巴细胞白血病发病率6，化学致癌物质不能诱发乳腺癌和卵巢囊肿，对结核杆菌有感受性。,可用于营养与肝癌发生率关系的研究，对鼠伤寒沙门氏菌C5有抵抗力，对酒精过敏。也可作为许多瘤株的宿主。,乳腺癌自发率低，肺癌发病率为26，网状细胞瘤8，血管瘤6，淋巴肉瘤45，乳腺癌3，对放射线极为敏感。,特点：a.实验结果比较准确，可以避免遗传组成不同或个体差异太大等所引起的误差。b.实验结果的平均性较一致。每组仅用较少数的动物，即能看出显著性来。c.实
3、验结果的重复性较大。e.易于获得预期结果。f.近交衰退。,2、突变系动物 在生长繁殖过程中，通过自然突变或人工定向突变的方法，使其某基因发生突变并丧失原有的正常功能。这种突变的基因可以世代相传并保持遗传基因特性的品系动物，称为突变系动物。,3、杂交群动物 指两个不同近交系之间有目的地进行交配所产生的第一代动物。,特点：a.具有纯系动物基本相似的遗传均质性。个体间遗传变异很小。b.表现双亲的显性性状 c.对各种实验结果重复性好d.具有杂种优势 e.国际上分布广,4、封闭群动物 指在5年以上不从外部引进新血缘，仅由同一品系的动物在固定场所保存繁殖的动物群。个体间具有一定程度的遗传学差异。封闭群动物
4、个体间差异的大小，取决于祖代的来源。,（三）微生物控制的选择1、无菌动物 germ free animal,GF 指体内外均无任何微生物和寄生虫的动物。经人工剖腹产净化培育而来。,2、悉生动物 gnotobiotic animal,GN 指体内带有已知微生物的动物。是经人工有计划地将已知菌投入动物体内。,3、无特定病原体动物 specific pathogen animal,SPF 指体内无特定的微生物和寄生虫的动物。即无传染病的动物，容许携带非特定微生物。,4、清洁动物 Clean animal,CL 也称最低限度疾病动物，动物体内外不携带人畜共患疾病的病原体或动物传染病病原体。,（四）个体
5、选择1、年龄 取决于实验类型。急性实验成年动物亚慢性、慢性实验较年幼或初断乳动物。在实际工作中常以动物体重粗略判断动物的年龄。各组动物的年龄应尽可能保持一致。,2、性别 不同性别的实验动物对化学物毒性的敏感程度有时会不同。一般选用雌雄两性。3、生理状态 一般选用未产未孕的雌性动物。雌雄分养。4、健康状况 应选用健康动物。一般试验前检疫观察57天,二、常用染毒方法（一）经口染毒1、灌胃 是将液态受试化合物或固态、气态化合物溶于某种溶剂中，配制成一定浓度，装入注射器等定量容器，经过导管注入胃内。,优点：剂量准确缺点：工作量大；可能损伤食道或误入气管；与人的接触方式差异很大。,2、吞咽胶囊 将一定剂
6、量受试化合物装入药用胶囊内，强制放到动物的后咽部迫使动物咽下。家兔及猫、狗等大动物可用此法。优点：剂量准确，尤其适用于易挥发、易水解和有异味的化合物。,3、喂饲 将化合物拌入饲料和水中，需计算每日进食量和饮水量，折算摄入剂量。优点：符合人接触化合物的方式 缺点：可能拒食；挥发性化合物可使摄入量下降，且有经过呼吸道吸入的可能；化合物易水解或与食物中的化学成分起反应。,（二）经呼吸道染毒1、静式吸入 在固定体积的密闭容器中，加入定量的易挥发液态化合物或气态化合物。将动物置于其中，一般2h。尤其是适用于小动物接触易挥发液态化合物的急性毒性研究。,优点：设备简单；操作方便；消耗化合物少缺点：柜内空气组
7、成、环境条件不稳定；化合物浓度难以恒定。,表5-1 实验动物最低需气量及不同体积染毒柜应放置动物数关系,浓度计算：C=a.d/L10001000（mg/m3）a加入化合物量（ml），d比重，L容积（L）,2、动式吸入 染毒柜空气流动 面罩吸入避免化合物经皮吸入 优点：剂量准确 缺点：装置复杂；消耗大；可能造成污染,（三）经皮肤染毒 用于研究化合物经皮肤吸收的毒性作用及化合物对接触皮肤的局部作用（皮肤刺激和致敏）,第二节 急性毒性及其评价方法,一、急性毒性的概念 急性毒性（acute toxicity）是指机体(人或实验动物)一次(或24小时内多次)接触外来化合物之后所引起的中毒效应。观察期可在
8、17天。实验动物接触化合物的方式或途径不同，“一次”的含义也有所不同。凡经口接触和各种方式的注射接触，“一次”是指在瞬间将受试化合物输入实验动物的体内。而经呼吸道吸入与经皮肤接触，“一次”是指在一个特定的期间内实验动物持续地接触受试化合物的过程,实验目的1.求出受试化合物对一种或几种实验动物的致死剂量(通常以LD50为主要参数)，以初步估计该化合物对人类毒害的危险性。2.阐明受试化合物急性毒性的剂量反应关系与中毒特征。3.研究化合物在机体内的生物转运和生物转化过程及其动力学变化。也可用于研究急救治疗措施4.为亚急性、慢性实验设计提供依据,二、急性毒性评价方法（一）经典的急性致死性毒性试验1、实
9、验动物 选用成年健康动物，常用大鼠和小鼠。各剂量组雌：雄1：1，出生23个月。数量1020只最佳。大动物每组6只。实验前至少观察一周，选取其中健康动物，随机分组。,2、染毒剂量设计（1）查阅文献：分析受试化合物的化学结构和其理化性质，依此查阅文献，找出与受试化合物化学结构与理化性质近似化合物的毒性资料，并以其LD50(LC50)值作为受试化合物的预期毒性中值。（2）试验：以文献LD50为中值，取倍差，设34个梯度，找出大致的LD10-90的范围。,（3）正式试验：I（logLD90logLD10）/（n-1）组距，即相邻两个剂量组对数差或相邻组比值的对数值。一般设57个剂量组。,限量实验：毒性
10、较小的化学物若无法求得LD50，则进行限量实验，单次染毒剂量5g/kg（体重），食品毒理学实验15g/kg（体重）。,3、观察 一般要求计算两周内的总死亡数。对于一些速死性化合物求其LD50(LC50)也可仅计算24小时的死亡率。应注明是多少时间的LD50值，以便于在进行毒性比较时有共同的基础。观察内容：（1）死亡情况（2）动物体重（3）中毒反应症状（4）病理学检查,4、LD50 计算,LD50是经统计学计算得到的毒性参数，并可报告其95可信限。LD50(LC50)值是一个统计量，较少受实验动物个体易感性差异的影响，较为准确，因此是最重要的急性毒性参数，也用来进行急性毒性分级。,直接回归法,将
11、剂量对数值与死亡率(概率单位)的关系，进行直线回归，用最小二乘法求出a、b值。代入直线方程：ya十bX。式中，X为剂量对数值，y为死亡率的概率单位。利用此式即可求得受试化学物的LD50及其95可信区间。,%0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0.2.67 2.95 3.12 3.25 3.36 3.45 3.52 3.59 3.66 10 3.72 3.77 3.82 3.87 3.92 3.96 4.01 4.05 4.08 4.12 20 4.16 4.19 4.23 4.26 4.29 4.33 4.36 4.39 4.42 4.45 30 4.48 4.50 4.53 4.56 4
12、.59 4.61 4.64 4.67 4.69 4.72 40 4.75 4.77 4.80 4.82 4.85 4.87 4.90 4.92 4.95 4.97 50 5.00 5.03 5.05 5.08 5.10 5.13 5.15 5.18 5.20 5.23 60 5.25 2.28 5.31 5.33 5.36 5.39 5.41 5.44 5.47 5.50 70 5.52 5.55 5.58 5.61 5.64 5.67 5.71 5.74 5.77 5.81 80 5.84 5.88 5.92 5.95 5.99 6.04 6.08 6.13 6.18 6.23 90 6.2
13、8 6.34 6.41 6.48 6.55 6.64 6.75 6.88 7.05 7.33,百分率-概率单位换算表,（二）急性毒性实验的其他方法,经典的急性毒性试验和LD50的缺点：消耗的动物量大获得的信息有限测得的LD50值实际上仅是近似值,五种化合物的LD50值的实验室间变异,1、固定剂量法,2、急性毒性分级法,3.上、下移动法(updown method)或阶梯法,第二个动物接受化学物的剂量由第一只动物染毒后的反应决定，如果动物死亡，则下一个剂量降低；如果动物存活则下一个剂量增高，但是实验需要选择一个比较合适的剂量范围，使得大部分的动物所接受的化学物剂量都会在真正的平均致死剂量左右。,
14、三、急性毒性分级 目前国际上对外源化学物急性毒性分级的标准不统一。,外源化学物急性毒性分级(WHO),我国食品毒理急性毒性分级法1994,课后作业,为什么用LD50作为比较化合物急性毒性的指标？有何优缺点？如何克服？,第三节 亚慢性、慢性毒性及其评价方法,一、亚慢性和慢性毒性试验的概念 亚慢性毒性(subchronic toxicity)是指实验动物连续(通常13个月)重复染毒外源化学物所引起的毒性效应；慢性毒性(chronic toxiciy)是指实验动物长期染毒外源化学物所引起的毒性效应。一般是连续染毒6个月至两年，甚至终生染毒。,二、亚慢性和慢性毒性试验的目的 1.确定受试物亚慢性和慢性
15、毒性的效应谱,并发现在急性及亚急性毒性试验中未发现的毒作用；2.研究受试物亚慢性和慢性毒作用的靶器官；3.研究受试物亚慢性和慢性毒性剂量-反应(效应)关系，确定其观察到有害作用的最低剂量(LOAEL)和未观察到有害作用的剂量(NOAEL)，提出此受试物的安全限量参考值；4.研究受试物亚慢性和慢性毒性损害的可逆性；5.亚慢性毒性试验为慢性毒性试验的剂量设计及观察指标选择提供依据；6.确定不同动物物种对受试物亚慢性和慢性毒效应的差异，为将毒性研究结果外推到人提供依据。,三、亚慢性毒性和慢性毒性的评价方法（一）实验动物 一般要求两种实验动物，一种为啮齿类，另一种为非啮齿类。实验动物最好为纯系甚至同窝
16、动物均匀分布于各剂量组。雌雄各半。亚慢性实验每组20只以上大鼠，慢性实验每组40100只。亚慢性毒性试验动物的体重(年龄)应较小，如小鼠应为15g左右，大鼠100g左右。慢性毒性实验动物年龄应更小，大鼠和小鼠应为初断奶者。,（二）染毒途径 尽量模拟人类的接触方式；应与预期进行慢性毒理试验的接触途径相一致。染毒时间每日应定时，以维持动物血液中浓度稳定。常用的染毒途径是经胃肠道、经呼吸道和皮肤染毒。,（三）染毒期限 工业接触毒物：亚慢性毒性13个月，慢性毒性6个月 环境毒物：亚慢性毒性36个月，慢性毒性12个月以上 如果慢性毒性实验与致癌实验结合，染毒期限最好是接近或等于终生染毒。,动物研究期限相
17、当于寿命期()和人染毒的时间,（四）剂量分组 至少3个剂量组和1个对照组。高剂量组：出现较明显的毒性效应，死亡率小于10或无死亡 中剂量组：轻微毒性，即观察到最低有害作用剂量（LOAEL）低剂量组：不出现中毒反应，即未观察到有害作用剂量（NOAEL）,亚慢性毒性实验：可参考两个数值，一是以急性毒性的阈剂量为亚慢性试验的最高剂量；一是以此化合物LD50的1/201/5为最高剂量。,慢性毒性实验：剂量的选择可参考三组数据。1、亚慢性NOAEL或其1/5 1/2剂量为慢性毒性试验的最高剂量，以这一阈剂量的1/501/10为慢性毒性试验的预计阈剂量组，并以其1/100为预计的慢性无作用剂量组2、亚慢性
18、试验的LOAEL的1/2、1/4、1/8分三组3、急性毒性的LD50剂量为出发点，即以LD50 的1/10剂量为慢性试验的最高剂量。以LD50的1/100为预计慢性阈剂量，以LD50 的1/1000为预计的无作用剂量组。,（五）观察指标1、中毒症状：每日观察动物有无中毒症状和程度，外观和行为有无异常2、体重：每周称重一次3、食物利用率：记录每日饲料消耗量，计算食物利用率（每摄入100g饲料所增长的体重克数）。4、实验室检查（1）血液学检查（2）尿液检查（3）血液生化检查,5、病理及病理组织学检查 凡是在实验过程中死亡的动物均应及时解剖检查，实验结束后所有动物都要杀死检查。慢性毒性实验在实验中期
19、进行一次检查。（1）系统解剖：包括肉眼观察,动物固定在解剖板上，解剖颈部(颌下腺、腮腺、局部淋巴结等)取一侧乳腺及腹部皮肤；开腹并扩展切口(胰、脾、生殖器官、肾、肾上腺、直肠、胃、十二指肠、空肠、回肠、肠系膜淋巴结、肝脏等)开胸(舌、喉、气管、甲状腺、甲状旁腺、食管、心、肺、胸腺)剥离左后肢(肌肉、坐骨神经、股骨)；头皮、耳；开颅(颅神经、脑组织、垂体)；暴露脊髓(取出脊髓),（2）脏器系数：也称脏体比值，是指某个脏器的湿重与单位体重的比值，通常以100g或1g体重计。此指标的意义是实验动物在不同年龄期，其各脏器与体重之间重量比值有一定规律；若受试化合物使某个脏器受到损害，则此比值就会发生改变
20、。脏体比值是一个灵敏、有效和经济的指标。（3）组织病理学检查：系统解剖时发现的异常组织要进行详细的组织病理学检查，必要时还需进行组织化学或电镜检查。,6、特异性指标,（六）结果分析 对污染组和对照组数据根据统计学方法处理，看是否有显著差异、剂量效应关系和时间效应关系。以及各项指标之间的相关性。,第四节 皮肤局部毒作用及其评价方法,一、皮肤局部毒性（1）皮肤原发性刺激：接触某种化学物后产生的局部可逆性炎症，包括水肿和红斑。（2）皮肤变态反应：皮肤对化学物产生的免疫源性反应，主要表现时红斑和水肿。可发生于接触部位以外的皮肤。（3）光刺激反应和光变态反应：化学物单独与皮肤接触无作用，经特定波长光照后
21、引起有害作用（4）皮肤癌（5）皮肤色素异常（6）对皮肤附件的损害：如毛发脱落、痤疮、汗腺损害等。,二、皮肤局部作用的评价方法（一）皮肤刺激试验 Draize实验主要以兔皮肤、有时也用大白鼠或豚鼠皮肤做试验，以各种浓度化学物对皮肤涂敷后观察红斑和水肿程度综合给分。,（二）皮肤变态反应试验 实验动物为白色豚鼠，体重200-300g，雌雄各半。分实验组、阴性对照组和阳性对照组，每组16只。试验组：受试物诱导和激发处理 阳性对照组：阳性致敏物诱导和激发处理 阴性对照组：受试物激发处理,操作：局部封闭涂皮法1、诱导处理：试验前24h背部左侧去毛 诱导浓度受试物0.5ml涂布 玻璃纸覆盖，无刺激胶布固定，持续6h 第7、14d同样方法重复一次2、激发处理：最后一次诱导后14d，激发浓度受试物0.5ml涂布右侧脱毛区，固定6h后洗去，24、48h后观察皮肤反应，评分,
