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1、PCR技术及其应用,1 PCR技术原理2 PCR技术应用,PCR技术简史,DNA的复制聚合酶链反应的发明,PCR技术简史,DNA的复制聚合酶链反应的发明,Kary B.Mullis,，1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年，Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,特定DNA片段,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,二、PCR的基本原理,PCR基本原理
2、类似于DNA的体内复制。在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR的基本步聚 1、变性(Denaturation)：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。2、退火(Annealing)：当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。3、延伸(Extension)：在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)及Mg2+存在条件下，53的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。,72,94,
3、55,PCR循环(30-40),变性,退火,延伸,PCR反应程序,PCR反应程序,PCR Cycle-Step 1-Denaturation Template DNA by Heat(95),Target Sequence,Target Sequence,PCR原理示意图,模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
4、,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,加热94,引物酶,模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,PCR Cycle-Step 2 Temperature is lowered(Tm)and primers anneal to target sequences,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,引物酶,3,5,3,5,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,引物,ATCGCGATAG
5、CGTAGCTGCGACCTAGC,引物,3,5,5,3,PCR Cycle-Step 3-At 72 Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNAPolymerase,引物的延伸：DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与
6、模板DNA 链。,3,5,3,5,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,DNA聚合酶,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,DNA聚合酶,5,5,3,3,引物,引物,End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequence,Target Sequence,Target Sequence,每完成一个循环需2-4 min，2-3 h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,3,5,3
7、,5,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,5,5,3,3,Target Amplification,No.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,824,1 cycle=2 Amplicon,2 cycle=4 Amplicon,3 cycle=8 Amplicon,4 cycle=16 Amplico
8、n,5 cycle=32 Amplicon,6 cycle=64 Amplicon,7 cycle=128 Amplicon,三、PCR反应,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,PCR仪,PCR仪,PCR仪,PCR反应过程,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,PCR反应过程,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1
9、,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数,PCR反应的特点,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,1、PCR反应成分,1）模板 单、双链D
10、NA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。模板不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ng DNA模板/100l。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。最好做浓度梯度对照从而确定最佳条件。,四、PCR反应体系,模板引物Taq DNA聚合酶4种dNTP混合物Mg2+10缓冲液,2）引物（1）浓度 0.1-0.5 M 浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。,引物是PCR特异性反应的关键；PCR产物的特异性取决于引物与模板脱氧核糖核酸互补的程度；人工合成的寡聚核苷酸引物需经离子交换HPLC进行纯化。,引物在反应中
11、的浓度要一致。如果引物浓度较大,在PCR产物检测时,在溴酚兰前面可以看到1条引物带(由于前后引物等大小)。如果引物太少,使得非特异性扩增发生,从而出现杂带。不同试验对浓度的要求也不一样,而引物浓度大对特异性PCR的结果影响不大,但是会造成试剂的浪费;引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体，二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.25-0.5pM/L较好。,（2)PCR引物的设计一般原则 根椐待扩增的DNA片段，设计其特异的上、下游引物,引物长度一般以18-30bp为宜，过短则降低特异
12、性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。G/C和A/T碱基均匀分布，G+C含量在40-60%之间，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带；ATGC尽可能选择碱基随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶连续排列。要避免两个引物间特别是3末端碱基序列互补以及同一引物自身3末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。,引物3末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3末端为G、C或T时引发效率较高。引物5末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切
13、酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。引物量：每条引物的浓度0.1-1 Ml或10-100 pM，以最低引物量产生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会,3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)目前有两种Taq脱氧核糖核酸聚合酶供应：天然酶：从栖热水生杆菌中提纯；基因工程酶：大肠菌合成；一般0.5-2.5 U/50l；酶量过少影响反应产量；浓度过高可引起会造成杂带、特异产物带不清晰等不好的结果，浓度过低则得不到所需的产物。最可靠的做法是
14、先做浓度对照,再根据结果决定最佳条件。,4）dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP 4）dNTP浓度取决于扩增片段的长度;四种dNTP浓度应相等;PCR常用的浓度为50-200M，不能低于10-15M。浓度过高会抑制Taq 酶的活性，易产生错误碱基的 掺入，浓度过低则降低反应产量;dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影 响DNA聚合酶的活性。,dNTP呈颗粒状，保存不当易变性失活dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0-7.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解；在PCR反应中，dN
15、TP应为50-200 M，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。,5）Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响。在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200 M/L时，Mg2+浓度为1.5-2.0 mM/L为宜Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高反应特异性降低，出现非特异扩增，就会出现红彤彤一片涂布。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,6）10PCR缓冲液
16、：500 mM KCl，100 mM Tris-HCl(pH 8.4)，150 mM MgCl2，1 mg/ml明胶。,PCR反应体系：10PCR buffer 10l dNTP mix 各200M 引物1 1M 引物2 1M DNA模板 50ng-1g Taq 酶 2U 加双蒸水至总体积为100l,PCR扩增程序:,94,300S 94,60S 55,60S 72,60S 72,7min,30 循环,PCR条件的优化,1、反应缓冲液：50 mM KCl，10 mM Tris-HCl(pH8.3，室温)，1.5 mM MgCl22、dNTP mix：常用终浓度为50-400M3、Taq DNA
17、聚合酶：2-4 U/100l4、引物5、模板：PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR的样品。6、循环,2、循环参数变性 使双链DNA解链为单链 95oC 20-40秒(2)退火 温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。,（3）延伸 70-75oC，延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加,PCR analysis of transgenic plants,M P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CK,M P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 CK,
