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1、实验 一、RNA提取及检测,一、实验目的掌握植物RNA RNA提取及检测方法二、实验试剂及材料水稻叶片、液氮、Trizol试剂、氯仿、异丙醇、DEPC水三、实验器材恒温水浴锅、PCR仪、台式低温离心机、移液枪、研钵、紫外分光光度计，一次性手套。,四、实验步骤 采用Trizol法提取RNA(50100mg组织ml trizol)，以加1ml Trizol为例，操作流程如下：(1)研钵加液氮数次至足够冷，加入样品，研磨至粉末。加入Trizol（每100mg组织加1ml的Trizol），充分研磨，放在室温下解冻。(2)除不溶性物质：28C下12000g离心10min，不溶性物质沉淀，将RNA的上清移
2、入1.5 ml离心管中。(3)相分离：在1530下放置5min，使核蛋白复合物完全解离。加0.2ml氯仿，剧烈振荡15 sec，室温下温浴23min。28下，12000g离心15min，RNA全部溶解于上层水相中，把水相移入另一1.5ml离心管中。,(4)氯仿再次去杂：加0.5ml氯仿，剧烈振荡15sec，室温下温浴23min；28下，12000g离心15min，把水相转入1.5ml离心管中。(5)RNA沉积：加入0.5ml异丙醇，1530温浴10min；2-8下，12000g离心10min，RNA沉积在离心管的底部及侧壁。(6)清洗RNA：加入1ml 75%乙醇，28下7500g离心5min
3、，小心将上清液倒掉。(7)再清洗：加入1ml 75%乙醇，28下，7500g离心5min，小心将上清液倒掉。(8)RNA的溶解：将离心管倒扣在吸水纸上510min，每管加30l的DEPC水，可在5560下助溶10min。,(9)RNA浓度：用DEPC水稀释100倍，用紫外分光光度计 测定OD值（260nm、280nm 230nm），估算RNA浓度。-70 保存。总RNA定量方法 RNA在260nm波长处有最大吸收峰。OD值为1相当于大约40g/ml的单链RNA。如用1cm光径，用 ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：RNA
4、（mg/ml）=40OD260读数稀释倍数(n)/1000,RNA浓度检测过程（1）取少量待测RNA样品，用DEPC 水稀释100倍。（2）用DEPC 水做空白，在260 nm、280 nm、230 nm处调节紫外分光光度计的读数至零。（3）加入待测RNA样品在三个波长处读取OD值。RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解。OD260/OD230比值应 2.0，若比值较低说明盐分过高。,电泳检测RNA质量：（1）配制1.2%的琼脂糖凝胶（20mL）称取琼脂糖0.24
5、g，加DEPC处理的ddH2O 12.04 mL，5RNA 电泳缓冲液4 mL，电炉加热融化琼脂糖，冷却至55C，加入甲醛1.96 mL，冷却后倒胶。（2）RNA电泳取去离子甲酰胺10 L，甲醛1.5 L，10 RNA Buffer 2 L，RNA(24 g,10 L)混合液，65C加热15min，迅速在冰浴中冷却片刻，然后加入3 L RNA 加样缓冲液和0.5 L EB，上样电泳。电泳Buffer 为1 RNA buffer。,（2）RNA电泳结果判别质量：出现的电泳条带有两条，是两条最大的核糖体RNA（rRNA）分子，即18S 和28S rRNA，较小的RNA也很丰富但看不到，因为太小，跑
6、出了凝胶的边界。多数细胞中的信使RNA（mRNA）经EB染色后不足以形成可见的带。只要18S 和28SrRNA带亮，且28S rRNA大约为18S rRNA 的两倍，说明提取的RNA没有发生降解，纯度好。,五、总RNA提取常见问题分析,RNA降解1、外源RNA酶的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。2、内源RNA酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。3、外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。样品取材后应立即置于液氮中速
7、冻，然后移至-70冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70冰箱中。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷。,OD260/OD280比值偏低1.蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。2.苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。3.多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD260/OD280
8、比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。4.设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD值时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。,RNA提取得率低1.该组织或者细胞中RNA含量偏低：不同细胞和组织中RNA的丰度不同，如肝脏，胰腺，心脏等是高丰度组织(总RNA含量2-4g/mg)，脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢等是中丰度组织(总RNA含量0.05-2g/mg)，膀胱，骨，脂肪等是低丰度组织(总RNA含量0.05g/mg)。2.组织起始量太少或者太多：样品量过少，则细胞组织中RNA含量较低；样品量过多则可能超过裂解液的裂解能力，裂解将不完全，从而导致RNA得率低。六、注意事项：1所有实验过程均须避免Rnase的污染。2要避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。3.样品量和Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。,
