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1、实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥,Arabidopsis thaliana,Nicotiana tabacum,选择标记基因与报告基因,必备条件：编码一种不存在于正常植物细胞中的酶基因较小能在转化体中得到充分表达检测容易，并且能定量分析选择标记基因与筛选标记基因：npt-II 新霉素磷酸转移酶基因（卡那，新霉素，G418），aat（链霉素，壮观霉素），spe（壮观霉素），strl（链霉素），cat（氯霉素），bar（草苷膦）报告基因：report gene（筛选标记之一）在转化系统中通过瞬时及稳定表达检测来确定转化的DNA顺序（基因）是否能在转化细胞中得到表达，起到报告的作用。gus基因（-葡萄
2、糖苷酸酶基因），gfp（绿色荧光蛋白基因）转化目的基因可以省略附加的报告基因，但选择标记基因是不可缺少的。,植物基因转化受体,高效稳定的再生能力较高的遗传稳定性具有稳定的外植体来源对选择性抗生素敏感对农杆菌侵染有敏感性,植物基因转化受体系统类型：愈伤组织再生系统直接分化再生系统原生质体再生系统胚状体再生系统生殖细胞受体系统,植物遗传转化方法,双子叶植物,无宿主限制，技术限制,原生质体培养,转基因方法,农杆菌侵染法,基因枪法,农杆菌侵染法,农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系,对单子叶植物不敏感,根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口
3、进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。,T-DNA整合植物基因组的分子机理,T-DNA在植物染色体中的插入是随机的，可插入任何一条染色体。插入位点特点：T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点T-DNA与植物DNA连接处富含A-T碱基对植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度的同源性。但在T-DNA的整合过程中常有植物基因组靶序列的缺失、倒位和重复等现象，T-DNA的整合一定程度上依赖于植物内源重组系统。总之，T-DNA的整合是通过植物靶DNA和T-DNA间短的同源区段发生重组而完成的，在接口附近伴有DNA顺序的转换和重复。,真空浸透法转化拟南芥,农杆菌侵染瞬时转化烟草
4、,注射法瞬时转化烟草,乙酰丁香酮,Vir区基因的活化直接调控着T-DNA的转移，酚类化合物对Vir区基因的活化具有重要作用。乙酰丁香酮（Acetosyringone，分子式:HOC6H2(OCH3)2COCH3）AS：遗传转化中常用的诱导能力较强的一种酚类化合物，乙酰丁香酮之所以能够提高外植体的转化频率，是因为它可诱导农杆菌Vir基因活化，从而促进外源基因的整合。使用方法：在侵染前4-6h加入液体培养基，使农杆菌既处于对数生长期，又处于vir基因高度活化状态，从而提高侵染能力悬浮离心后用植物外植体培养基稀释成侵染液时加入加在农杆菌和外植体共培养的培养基中，一般农杆菌附着16h后才能进行转化在农
5、杆菌液体培养基及共培养基中都加入AS,Silwet L-77,拟南芥、油菜等转化必须试剂之一，原产地为美国GE公司，Silwet-L77高效有机硅表面活性剂，能够极大的降低水的表面张力(水的表面张力为72.4mN/m，0.1%的Silwet-L77系列有机硅溶液的表面张力约为21mN/m),这使Silwet-L77有机硅溶液可轻易湿润几乎所有种类的叶面,相对于传统助剂,显著提高了在靶标生物的覆盖面.同时，Silwet-L77有机硅助剂具有极强的耐水冲刷及渗透能力。Silwet-L77是拟南芥及其它作物常用的转基因用表面活性剂。,植物瞬时表达系统,当外源基因导入植物细胞中以后，其表达方式有瞬时表
6、达（transientexpression）和稳定表达（stable expression）两种。在瞬时表达状态的基因转移中，引入细胞的外源DNA和宿主细胞染色体DNA并不发生整合。这些DNA一般随载体进入细胞后12小时内就可以表达，并持续约80小时左右。在稳定表达状态的基因转移中，导入宿主细胞的DNA整合到细胞染色体DNA上，以永久形式存在，并可传给后代，形成稳定的转化细胞。植物瞬时表达系统在启动子分析、基因功能分析和生产重组蛋白方面用途广泛。,Gus基因,gus基因来源于E.coli染色体上的uid A位点。编码-葡萄糖苷酸酶。-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应产物可用多种方法检测出来。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中。根据gus基因检测所用的底物不同，检测方法有：组织化学法、分光光度法和荧光法。,操作要点,侵染烟草叶片无菌操作注意事项抗生素的正确使用及抗生素敏感性实验新鲜的叶片转化效率高侵染前去除拟南芥已开花和果荚侵染后筛选再生植株要注意抑制农杆菌生长侵染后共培养一般为暗培养，12d，使农杆菌繁殖迅速，提高转化效率。,实验报告,实验目的实验原理（简略写）实验方法实验结果及分析（最重要）思考题（最后一次课给）,切勿相互抄袭，支持原创，如有雷同后果自负！,
