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1、,FCM在免疫学中的应用,一、流式细胞免疫学样品制备的基本原理,流式免疫技术是以单细胞或单细胞核为研究对象，并结合传统的免疫学方法，其基本原理是，细胞上的抗原(或细胞膜受体)与相应的单克隆抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合物，通过流式细胞术测定其特定荧光量,二、流式免疫学染色方法,免疫样品的制备要求：1.一定数量的单细胞悬液，这是流式测定的基础，如果悬液细胞数量过少，测定结果的准确性可能会受到影响2.死细胞和碎片在某些免疫荧光样品测定中，有可能干扰免疫荧光的分布，应予以排除，以免引起测定结果的假阴性或假阳性,免疫样品的制备要求：,3.荧光素所发荧光的强度与结合位点多少应成正比，在通常情况下，
2、流式免疫样品的制备采用直接或间接免疫标记法,二、流式免疫学染色方法,二、流式免疫学染色方法,直接免疫荧光标记法：,取与荧光素交联的抗体直接加入一定量的细胞(约1l06细胞/ml)悬液中，进行免疫标记反应。如做双参数标记染色，可把两种分别标有不同荧光素的抗体同时加入,二、流式免疫学染色方法,直接免疫荧光标记法：,二、流式免疫学染色方法,直接免疫荧光标记法：,2 标记反应一定时间后，用PBS液(pH7.2-7.4)洗涤细胞悬液两次，离心后重新悬浮于缓冲液中，上机检测,二、流式免疫学染色方法,直接免疫荧光标记法：,优点：所测结果准确，操作简便，阴阳性结果易分析，适用于同一细胞群体多种参量标记的测定,
3、二、流式免疫学染色方法,直接免疫荧光标记法：,缺点：在检查每一抗原时都要制备与抗原相应的荧光标记抗体，不但荧光抗体制备复杂，而且费用昂贵，另外其敏感性也较间接法稍差,二、流式免疫学染色方法,间接免疫荧光标记法：,取一定量的细胞或细胞核悬液约 1x106 细胞/ml 加入特异的第一抗体，待结合反应一定时间后，洗去多余的抗体，加入荧光标记的第二抗体，形成一种抗原抗体抗抗体免疫复合物，通过FCM检测其荧光,二、流式免疫学染色方法,间接免疫荧光标记法：,二、流式免疫学染色方法,间接免疫荧光标记法：,优点：操作较简单，费用较低，只要制备相关的第一抗体，二抗可较广泛的应用。,二、流式免疫学染色方法,间接免
4、疫荧光标记法：,缺点：由于二抗常为多克隆抗体，非特异性荧光背景较强，非特异性结合较多，影响了实验结果的分析，因此，在样品制备的同时应增设阴阳性对照，避免测定结果的假阳性，另外，由于间接免疫荧光标记步骤较多，增加了细胞的丢失,三、免疫荧光测定的标本处理技术,混合细胞群体的区分：,在制备好的单细胞悬液中，常含有不同大小、形 状 的 细 胞 群，对于不同的细胞群，常用90光散射和前向角散射区分其体积大小，然后可以通过计算机画出地形图，等高线图或点阵图，画出不同细胞群的范围，选择有用的细胞群体,三、免疫荧光测定的标本处理技术,混合细胞群体的区分：,三、免疫荧光测定的标本处理技术,混合细胞群体的区分：,
5、这种区分细胞群体的方法简便。然而，固定剂固定后的细胞可能会改变某些细胞的光散射的特性，在区分细胞群体时应加以考虑。常用的另一种区分细胞的方法是利用某些染料对死活细胞膜的穿透性不同，核着色与否这些特点进行区分,三、免疫荧光测定的标本处理技术,混合细胞群体的区分：,如PI染料染色培养后的细胞，死细胞内有PI染料发出较强的荧光，而活细胞由于膜的选择性通透，阻挡了PI染料进入细胞内，因此所发出的荧光很弱,三、免疫荧光测定的标本处理技术,免疫荧光染料,常用的免疫荧光染料有：异硫氰荧光素(FITC)藻胆蛋白类染料 藻红蛋白(PE)藻青蛋白 别藻红蛋白德州红(Texas Red),三、免疫荧光测定的标本处理
6、技术,免疫荧光染料：,这几种染料都能与纯化的单克隆抗体结合，可以在较广范的波长范围内被有效地激发，其发射光容易被区分，分别为红、绿橙色,三、免疫荧光测定的标本处理技术,免疫荧光染料：,用两种染料结合两种不同的抗体，每一种细胞结合抗体的荧光都是不同的，用不同的探测器测定不同的发射波长，这样可以同时检测一个细胞的两个参数,三、免疫荧光测定的标本处理技术,免疫荧光染料：,FITC和PE两种染料都可以在488nm被激发，它们可同时与两种不同的抗体结合，FITC的荧光发射在绿区，大约530nm，而PE的发射在橙红区，大约在570nm以上，它们适用于同时区分不同抗原位点的细胞群,三、免疫荧光测定的标本处理
7、技术,标本的保存和固定：,在实验中，染色后的标本常常不能及时上机检测。在这种情况下，应该把染好的标本进行固定,三、免疫荧光测定的标本处理技术,标本的保存和固定：,FCM免疫方法对固定剂的要求比较严格，固定剂必须有效地固定细胞并保护细胞内抗原或细胞膜表面抗原特性不受破坏，又必须使被固定细胞的细胞膜对抗体有一定的通透性，使其能够进入细胞内与相应抗原结合,三、免疫荧光测定的标本处理技术,标本的保存和固定：,醇类、醛类固定剂易导致所固定的细胞缩小变形，一般常用1-4%的多聚甲醛缓冲液(pH7.4)进行固定，或用0.37-1.5%的甲醛缓冲液(pH7.4)固定，固定液加入后混匀置4储存，一般不超过一周，
8、在上机前用PBS或相应的缓冲液洗涤,三、免疫荧光测定的标本处理技术,标本的保存和固定：,这种固定方法对染色后的标本来说，固定程序简单，对细胞体积，光散射及荧光特性都无明显影响。另外，这些醛类的固定剂的另一优点是具有消毒作用，能够杀灭组织中存在的各类肝炎病毒，也可灭活其他传染性毒素，对工作人员的自我保护来说，它是很好的固定剂和消毒液,三、免疫荧光测定的标本处理技术,标本的保存和固定：,同时，在单细胞悬液制备过程中不能使用酶消化方法，否则将破坏细胞膜表面抗原物质结构,三、免疫荧光测定的标本处理技术,阳性标准和阴性对照：,在FCM样品制备过程中，不同细胞亚群的免疫荧光测定，应设定一个阳性与阴性对照,
9、三、免疫荧光测定的标本处理技术,阳性标准和阴性对照：,如对淋巴细胞和白细胞悬液用抗白细胞抗体和抗淋巴细胞抗体进行标记，将细胞悬液分为三份,三、免疫荧光测定的标本处理技术,阳性标准和阴性对照：,第一份细胞悬液直接加入二抗(FITc-羊抗鼠IgG)；第二份悬液先加入抗白细胞抗体，然后在加入第二抗体；第三份悬液先加入抗淋巴细胞单克隆抗体，再加入第二抗体,三、免疫荧光测定的标本处理技术,阳性标准和阴性对照：,分别将这三种标记后的细胞悬液上机检测，第一份悬液细胞的荧光强度最低，无阳性结合细胞，第二份有少量的细胞表达，说明该悬液中自细胞较少，第三份有较多的阳性细胞表达，证明有大量的淋巴细胞存在,四、T淋巴
10、细胞及其亚群免疫标记,与人体免疫功能有关的主要是淋巴细胞，具有细胞免疫功能主要是淋巴细胞中的T细胞亚群，而B细胞与体液免疫功能有关,四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记,T细胞亚群的功能:,T细胞亚群在适应性免疫应答中起着关键作用，T细胞亚群的变化直接影响机体的免疫状态的强弱和结局，对于适应性免疫反应功能在时间、空间层面上的质与量的评价，可以通过T细胞亚群分布和功能检测来实现,四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记,T细胞亚群的功能:,目前越来越多的研究表明，T淋巴细胞亚群在各种临床疾病(如：造血系统疾病，病毒感染和恶性肿瘤等)都有异常改变。在各种疾病的发生发展过程中测定人外周血中T抑制(T8)和T辅助(T
11、4)淋巴细胞亚群比例，可用来评价体内细胞免疫调节平衡状态,四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记,T细胞亚群的功能:,测定T亚群的相对标记率，特别是T细胞的免疫调节功能，可以帮助研究各种与免疫有关的疾病发病机制。所以，它可以作为临床免疫研究的手段，成为临床检验的一项重要指标,四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记,T细胞的功能及检测参数：,抗原识别：主要通过检测T细胞受体(简称为TCR)与其相应的配体(MHC-主要组织相容性复合物)2 T细胞活化：活化早期可以检测活化的表型物质CD25、CD71、CD69或MHC-分子和细胞因子IFN-、TNF-2等。也可检测细胞内钙离子升高和酪氨酸磷酸化酶等,四、T淋巴细胞
12、及其亚群免疫标记,T细胞的功能及检测参数：,T细胞增殖：DNA细胞周期和Brdu掺入法，或者分析细胞周期相关蛋白等(如Cyclin-D1、D2、D3、E）4 T细胞克隆扩增：可以检测T细胞受体V基因片断产物，应用其相应单克隆抗体，定量分析基因片断的取用频率，这是一项检测T细胞克隆的新技术,四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记,T细胞的功能及检测参数：,T细胞分化：Th(Th1 Th2)，Ts(Tsc/Ts)可以用细胞内细胞因子以及体液或培养液中的细胞因子，应用微球夹心免疫荧光法，这是近年来发展的一项新技术,四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记,T细胞的功能及检测参数：,6 T细胞的效应作用：可以检测Fas
13、、FasL、颗粒酶或可检测细胞内凋亡指数Annexin-V(磷酸酯丝氨酸酶)等，也可检测Caspase酶(凋亡酶系统),T细胞免疫记忆功能：常用 CD45亚型(CD45RO),四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记,T细胞的免疫表型：,根据T淋巴细胞免疫表型和功能分为T总淋巴细胞 CD3+T辅助性细胞 CD4+/CD3+T抑制性细胞 CD8+/CD3+NK细胞 CD56+/CD3+,四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记,四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记,四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记,四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记,FCM检测T细胞亚群的参考值：,四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记,T细胞亚群的生物学意义：,1
14、T3+升高、T4+升高提示免疫功能增强，在这里并不单指细胞数量增加，还应该将T3+、T4+表达量(荧光量)增加也视为免疫功能增强,四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记,T细胞亚群的生物学意义：,2 T8+升高提示免疫功能降低，但是T抑制细胞中有一群T毒性细胞，当T毒性细胞增高时常产生自体及异体细胞破坏功能增强，那将造成自身免疫性疾病的发生，在器官移植术后产生对异体器官的排异反应,四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记,T细胞亚群的生物学意义：,3 NK细胞表达阳性增加，表达自然杀伤功能增强和执行免疫监视功能增强,四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记,T细胞亚群的生物学意义：,T4/T8比值升高提示免疫功能增强，但
15、常与一些自身免疫性疾病有关(如类风湿、塞莱斯氏综合症)T4/T8比值降低提示免疫功能降低，如在恶性肿瘤、病毒感染、再障性贫血等，尤其在AIDS病时具有特异性极高的诊断价值,四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记,T细胞亚群流式免疫标记程序：,在进行淋巴细胞亚群标记时，目前人们常利用全血进行标记，在加入抗体后加入lysing红细胞溶解液，3-5min后，加入PBS洗去血红蛋白，并重新悬浮于lml PBS中，上机检测，该方法的优点是，用血量少，一般每种抗体用全血20ul即可，且操作步骤简便,四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记,T细胞亚群流式免疫标记程序：,Lysing溶解液的配制:0.83%氯化胺，0.55m
16、M Na-EDTA0.1%碳酸氢钾，调pH7.3,四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记,T细胞亚群流式免疫标记程序：,免疫荧光直接标记法,l)取淋巴细胞混悬液l106细胞/ml，50ul2)加入标有荧光素的单克隆抗体工作液50ul3)37水浴30min，避光4)加入PBS 10ml，混匀5)离心1000rpm，10min，弃上清,四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记,T细胞亚群流式免疫标记程序：,免疫荧光直接标记法,6)重复4、5步骤7)加入1ml PBS 缓冲液混匀8)上机检测,四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记,T细胞亚群流式免疫标记程序：,免疫荧光间接标记法,l)取淋巴细胞混悬液l106细胞/ml，50
17、ul2)加入抗T细胞亚群的单抗工作液50ul3)37水浴30min4)加入PBS 10ml混匀5)离心1000rpm，10min，弃上清,四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记,T细胞亚群流式免疫标记程序：,免疫荧光间接标记法,6)加入FITC羊抗鼠IgG第二抗体50ul7)37水浴30min，避光8)加入10ml PBS，混匀9)离心1000rpm，10min，弃上清,四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记,T细胞亚群流式免疫标记程序：,免疫荧光间接标记法,l0)重复8、9步骤11)加入1ml PBS 液混匀12)上机检测,五、造血系统的分化抗原及白血病抗原标记,骨髓是一个细胞群体的造血器官，正常人出生后，
18、它是血细胞唯一的生长、发育、分化的场所，淋巴、单核、巨噬、粒系在正常分化成熟过程的不同阶段出现或消失细胞表面抗原。这些抗原是具有一定功能的生物效应分子，它们参与免疫应答和调控作用,五、造血系统的分化抗原及白血病抗原标记,白血病是白细胞在分化到某个阶段受阻后呈克隆性异常增殖的结果，它的发病是多阶段的。不同病因引起的白血病其发病机制不同，利用白细胞分化不同阶段出现的细胞表面标志可以对白血病进行免疫分型,五、造血系统的分化抗原及白血病抗原标记,用单抗可以将急淋分为:T细胞急淋(T-ALL)，B细胞急淋(B-ALL)，普通型急淋(C-ALL)和无标志型急淋(NULL-ALL)。它们在治疗和预后上不同，
19、所以，利用不同类型白血病细胞上表达某些分化抗原这一特点，可以对白血病进行详细分型，并给予导向治疗,五、造血系统的分化抗原及白血病抗原标记,此外，白血病细胞膜表面标记的表达与预后之间也有密切关系,流式免疫荧光标记造血系统的细胞抗原，其基本原理，实验方法，步骤与淋巴细胞亚群免疫标记相同，不再赘述,六、血小板膜表面受体的标记,血小板是巨核细胞分化成熟后，巨核细胞浆裂解脱落的小块细胞质，它的最表层富含糖蛋白和一些酶，是血小板表面特异吸附的血浆成分，也是血小板粘着、聚集的反应部位，血小板膜上含有多种与凝血有关的因子，在止血，凝血，维持血管内皮的完整性方面具有重要的生理功能,六、血小板膜表面受体的标记,目
20、前认为与血小板有关的血小板膜受体有2b、3a、2b-3a复合物，1b、VWF、GMP-140、Fg等。其检测方法不尽相同，有SDA-PAGE法，交叉免疫电泳法，这种方法难于检出较低含量的膜受体，而免疫印迹法的灵敏度较高，但标本用量大，操作复杂耗时长，膜纯化过程中受体变化大，易丢失。临床实验室较少应用放免法，易受其他细胞的干扰或一个抗原分子结合多个抗体而导致测定结果偏高等缺点,六、血小板膜表面受体的标记,用FCM检测血小板膜受体，是分析血小板方法学上的重要进展，它从分子水平诊断血小板功能和数量的异常，方法操作简便、快速、特异和准确度高，重复性好，且标本的用量少，能灵敏地从大量血小板中检出2%受体
21、阳性或阴性的血小板。因此，流式细胞测定血小板膜受体数量和功能很适合作为临床检验,六、血小板膜表面受体的标记,1.血小板悬液的制备1)聚丙烯一次注射器取静脉血1-2ml，用3.8%的枸橼酸钠或1%Na2EDTA抗凝置塑料管中。2)800转/分离心10分钟，取上层血浆，可获得富血小板血浆(PRP)。3)将PRP3500转/分离心15分钟,血小板沉淀弃上清,六、血小板膜表面受体的标记,血小板悬液的制备4)加入0.2ml ACD溶液悬液悬浮，再加入1ml，Tyrode液，混匀。5)离心3000转/分15分钟，弃上清。6)重复4.5步骤。7)加入lml 2%多聚甲醛，或2%戊二醛，室温30分钟，将其血小
22、板固定，放置4冰箱保存可达1个月之久,六、血小板膜表面受体的标记,2.血小板膜受体的标记步骤1)取固定后的血小板悬液离心2500转/分，10分钟，去上清。2)加入抗血小板膜受体的相应抗体工作液0.lml，室温孵育30分钟。3)加入5mlTES悬浮液2500转/分，离心10分钟，弃上清，并悬浮,4)加入FITC羊抗IgG第二抗体工作液0.1ml室温孵育30分钟。5)重复3)步骤。6)加入lmlTES悬浮液将血小板悬浮。7)上机检测,六、血小板膜表面受体的标记,2.血小板膜受体的标记步骤,七、FCM在AIDS病检测的应用,爱滋病又称获得性免疫缺陷综合症(AIDS)，是一种近年来新发现的免疫性疾病。
23、其临床表现为全身衰竭，免疫机制破坏造成免疫功能下降,本病多发于男女青壮年，主要通过性接触或感染 和 血 液 传播，由于传染性强和病死率极高，有 人 称 AIDS 病 为20 世纪的瘟疫和超级癌症，成为世界卫生组织重点控制监测的疾病之一，也成为当今医学卫生防治的重点研究课题,七、FCM在AIDS病检测的应用,人类一旦感染HIV之后，HIV主要选择地侵入人类具有重要免疫功能的T淋巴细胞亚群中的T辅助性细胞(其免疫表型 CD4Th，在其侵入Th细胞后，病毒失去被膜，经逆转录后形成单链DNA，再转录后形成双链在病人的T淋巴细胞中循环复制，使具有重要免疫功能的T细胞群破坏，相继累及全身免疫功能器官，使全
24、身免疫状态下降,七、FCM在AIDS病检测的应用,AIDS病的一个特征的免疫学诊断指标，T淋巴细胞总数减少(正常为65-81%)T细胞亚群比值倒置，Th/Ts1.0(正常为1.3-2.1：1)尤以Th细胞下降显著(正常在44-50%)在920%左右，而Ts细胞增高(正常值2729%)至35-50%，NK细胞减少或活力下降，但B淋巴细胞群则在正常范围，Tc亚群的单克隆抗体CD3、CD4、CD8已大量生产,七、FCM在AIDS病检测的应用,流式细胞术用于AIDS病免疫功能的检测是一个重要的先进方法，使用直标或间标免疫荧光法，同时对TH(CD4)和TS(CD8)进行双参数标记或三参数标记测定计数，目前国内外都已进行了大量FCM检测AIDS 病免疫功能研究，发现CD4的T细胞绝对数进行性减少，FCM与抗Tc亚群单抗的结合应用，将在AIDS病的检测和研究方面起重要作用,四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记,FCM检测T细胞亚群的参考值：,
