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1、蛋白质的等电点测定和沉淀反应,蛋白质的性质实验,【实验目的】,了解蛋白质的两性解离性质。学习测定蛋白质等电点的一种方法。加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。了解蛋白质变性与沉淀的关系。,【实验原理】,蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点（pI）。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测定其溶解度最低时的溶液pH值
2、。本实验借观察酪蛋白在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠配制成各种不同pH值的缓冲液。向各缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。,在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为两类：一类是可逆的沉淀反应，此时蛋白质分子的结构尚未发生变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此反应。另一类是不可逆
3、的沉淀反应，此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。如加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。,蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。可逆沉淀如无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。不可逆沉淀如蛋白质可与重金属离子结合
4、成不溶于水的复合物。,【实验器材】,水浴锅温度计200mL锥形瓶100mL容量瓶吸管试管及试管架乳钵,【材料与试剂】,0.4%酪蛋白醋酸钠溶液：称取0.4g酪蛋白（干酪素），加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬浮液移入200mL锥形瓶内，用少量4050的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10mL 1mol/L醋酸钠溶液。把锥形瓶放到50水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移至100mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。1mol/L醋酸溶液0.1mol/L醋酸溶液0.01mol/L醋酸溶液蛋白质溶液：5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡
5、蛋清:水=1:9）0.2mol/LpH4.7醋酸-醋酸钠的缓冲液：先配制A液与B液，取A液1770mL，B液1230mL混合即得pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3000mL。A液（0.2mol/L醋酸钠溶液）：称NaAc3H2O 54.44g，定容至2000mL。B液（0.2mol/L醋酸溶液）：称优级纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000mL。,3%硝酸银溶液5%三氯乙酸溶液95%乙醇饱和硫酸铵溶液硫酸铵结晶粉末0.1mol/L盐酸溶液,0.1mol/L氢氧化钠溶液0.05mol/L碳酸钠溶液甲基红溶液（Methyl red）：称取0.1g甲基红溶于，用水稀释到250mL，变色范
6、围4.4（红）6.2（黄）,【操作方法】,（一）等电点的测定取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4管的pH依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10min后，再观察其混浊度。最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。注意：在测定等电点的实验中，要求各种试剂的浓度和加入的量相当准确。,（二）蛋白质的盐析加5%卵清蛋白溶液5mL于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵
7、粉末倒不在溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。取出部分清蛋白，加少量水，观察沉淀的再溶解。,（三）重金属离子沉淀蛋白质取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加3%硝酸银溶液12滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？（四）某些有机酸沉淀蛋白质取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加入1mL 5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解？,（五）有机溶剂沉淀蛋白质取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加入2mL 95%乙醇溶液，混匀，观察沉淀的生成。（六）乙醇引起的变性与沉淀取3支试管，编号。依下表顺序加入各试剂（mL）：振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻，向各管内加水8mL，然后在第2、3号管中各加一滴甲基红，再分别用0.1mol/L醋酸溶液及0.05mol/L碳酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管再加0.1mol/L盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管发生的全部现象。注意：详细记录观察结果，并解释现象。,【思考题】,何谓蛋白质的等电点和沉淀反应？有何实用意义？详细记录各实验的结果和现象，并解释这些现象？,
