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1、内容提要：1.肿瘤发生中的细胞生物学机制2.体外培养肿瘤细胞特点3.肿瘤细胞培养中常用技术抗癌药物敏感性试验肿瘤细胞转移体外模型的建立,细胞凋亡细胞增殖失控与端粒酶细胞分化侵袭与转移抑癌基因失活原癌基因激活,一、肿瘤发生中的细胞生物学机制,二、肿瘤体外培养细胞优点：1.免受机体内部因素影响2.可长期保存3.快速筛选抗癌药4.费用低缺点：与体内环境有差异，应结合体内试验,肿瘤细胞取材及培养一般取自患者。实体瘤：原发癌组织或转移灶胸、腹腔炎：胸水或腹水白血病：血液或骨髓液注：取材后及时培养勿放置过久,常用的肿瘤细胞系1.www.atcc.org 2.http:/,三、肿瘤细胞培养中常用技术1.抗癌
2、药物敏感性试验2.肿瘤细胞转移体外模型的建立,1.抗癌药物敏感性试验美蓝法染料排斥法生长曲线测定法集落形成试验法MTT比色法裸鼠成瘤实验法,美蓝法原理：利用活细胞的脱氢酶提供氢离子，使甲烯蓝（美蓝）还原为甲烯白（无色），细胞死亡之后，脱氢酶失活，无法使甲烯蓝还原，因此被染成蓝色，检测用药后的死细胞数能反映药物的抑瘤作用。缺点：假阳性率高,台盼蓝排斥试验原理：台盼蓝能使死细胞着色（淡蓝色），而活细胞拒染。活细胞总数100活细胞率（）活细胞总数死细胞总数注意：简单，最常用。染色时间不宜过长,生长曲线测定法原理：癌细胞在最适条件下呈指数生长，当细胞处于对数生长期时用于试验，以细胞数的对数与培养时间可
3、得一条生长曲线，比较加药组合对照组细胞生长曲线，可反映出药物对肿瘤细胞生长的影响。,d,Cell number(104),lg,计算药物对细胞的杀伤率、药物对细胞倍增时间影响、药物对细胞生长饱和密度影响,集落形成试验法原理：肿瘤细胞系由不同比例增殖及分化能力不同的细胞组成，其中含有极少部分具有自我复制和增值能力的干细胞，具有分化和形成集落的特性，约占1%，其与肿瘤治愈、复发或转移密切相关。因其具有分化及形成集落的能力，故用集落法可体外检测抗癌药物敏感性。,四唑盐（MTT）比色法,商品名为噻唑蓝原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞
4、没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。,XTT比色法：与MTT类似，但产生的橙黄色甲儹（formazan）溶于水。缺点：水溶液不稳定，需低温保存或现用现配。CCK-8比色法：1.产生的formazan都是水溶性，检测灵敏度更高。2.更加稳定，酚红和血清对其测定无明显影响对细胞无明显毒性，3.加入显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，便于找到最佳测定时间,放射性同位素掺入法 危险性大，少用,裸鼠成瘤实验
5、法（详见下章）,裸鼠特点：先天性无胸腺，故胸腺依赖的免疫功能缺乏异种移植无排斥反应，可进行人体肿瘤移植，且形成的肿瘤仍能保留原有组织学形态、特点。,应用：1.体外瘤培养细胞株的鉴定2.研究肿瘤在体内的生物学行为3.药物作用机理研究,2.肿瘤细胞转移体外模型的建立,转移过程：癌细胞从原发灶脱落，形成转移灶浸润到靶目标：对靶目标基底膜的黏附、破坏基底膜、浸润。此过程为抑制癌转移药物筛选、开发提供思路。,模型主要包括：1）细胞体外黏附实验2）肿瘤细胞迁移实验3）肿瘤细胞侵袭实验4）肿瘤转移试验,1）细胞体外黏附实验,细胞黏附性：肿瘤细胞通过膜表面受体（整合素、钙粘蛋白和层粘蛋白受体）黏附于基底膜及细
6、胞外基质成分上（如纤维连接蛋白、层粘蛋白和IV型胶原蛋白）。作用：维持细胞外形、调节细胞分裂、运动。黏附是癌细胞侵袭的开始。,（1）肿瘤细胞在细胞外基质上黏附的测定原理：高侵袭的肿瘤细胞与基底膜成分的异质性黏附能力通常增高，而肿瘤细胞间的同质性黏附能力则会下降。此特性有利于肿瘤细胞与肿瘤母体的分离，并侵犯基底膜等正常组织。主要试剂：人工重构基底膜材料Matrigel（主要成分为层粘蛋白和IV型胶原蛋白）、纤维连接蛋白（FN）、小牛血清白蛋白（BSA）、MTT。,方法步骤：1）包被基底膜 2）水化基底膜 3）接种并培养细胞 4）MTT检测黏附率（%）=（实验组细胞A值/BSA组细胞A值）-1 1
7、00,（2）肿瘤细胞与内皮细胞黏附测定 肿瘤细胞与脉管内皮细胞的黏附有利于其在脉管壁着床。原理：利用肿瘤细胞对活性染料Rose Bengal的摄取量来检测肿瘤细胞与内皮细胞的黏附反应。体外培养细胞摄取Rose Bengal后，整个胞浆被染红，肿瘤细胞数越多，摄取的染料越多，吸光度A值越大。内皮细胞对染料摄取少且稳定，A值基本不变。,方法:96孔板底层铺单层胎儿脐静脉内皮细胞，上层铺肿瘤细胞，染色后，用ELISA仪测A值。A值=内皮细胞和肿瘤细胞A值-内皮细胞A值,2）肿瘤细胞迁移实验,原理：迁移是肿瘤细胞转移过程中必不可少的环节之一。肿瘤细胞侵袭周边正常组织需要一定的运动能力。高转移的肿瘤细胞
8、通常具有较强的运动性。多种物质可刺激肿瘤细胞的迁移，如肿瘤细胞分泌因子、生长因子、细胞外基质成分等对肿瘤细胞有趋化作用，可使其发生定向运动。方法：创伤试验模型、培养小室模型等,（1）创伤实验模型 本法借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，测定肿瘤细胞在细胞外基质上的运动特性。主要试剂：人工重构基底膜材料Matrigel（主要成分为层粘蛋白和IV型胶原蛋白）、纤维连接蛋白（FN）、小牛血清白蛋白（BSA）。,方法步骤：1）包被基底膜 2）水化基底膜 3）接种并培养细胞 4）人工划痕并测定原始距离（加入药物）5）测量迁移距离：根据原始距离计算细胞实际迁移距离,（2）培养小室模型,原理：体外培养肿瘤细胞在趋
9、化作用下可穿过多孔生物膜，穿膜细胞经染色后显微镜下计数或MTT比色测定OD值。优点：操作简单，实验周期短、易定量分析。应用：研究细胞分化和细胞与基质的相互作用、观察药物对细胞侵袭的影响。,（3）琼脂糖滴模型,原理方法：将癌细胞、培养液和琼脂糖混合成琼脂糖细胞悬液，然后在培养板或培养皿底制成琼脂糖小滴，经低温凝固，加入培养液培养，不同时间测量肿瘤细胞从琼脂糖滴边缘移出的距离，评价肿瘤细胞移动能力。,3）肿瘤侵袭实验,1）体内癌细胞侵袭模型皮下移植侵袭模型肌肉内移植侵袭模型腹腔内移植侵袭模型小鼠肾包膜下移植侵袭模型鼠睾丸包膜下移植侵袭模型小鼠耳廓皮下移植侵袭模型鼠爪垫皮下移植侵袭模型视网内界膜侵袭
10、模型,2）体外癌细胞侵袭模型体外静止器官培养法半体外半体内器官培养法单层细胞器官培养法瘤细胞球体器官培养法单层细胞侵袭实验模型Transwell侵袭小室测定法,Transwell侵袭小室测定法,外形为一个可放置在孔板里的小杯子，杯子底层的一张有通透性的膜，一般常用的是聚碳酸酯膜，将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。细胞种在上室内，可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。,常见
11、实验：(1).共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。,(2).趋化性实验 可用5.0、8.0、12.0m膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。,(3).肿瘤细胞迁移实验 常用8.0、12.0m膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某
12、些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。,(4).肿瘤细胞侵袭实验 常用8.0、12.0m膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。,方法步骤：1.Transwell小室制备 包被基底膜（若有基质胶此步略去）：水化基底膜：2.制备细胞悬液 3.接种细胞 4.结果统计：直接计数法、间接计数法,直接计数法：“贴壁”细胞计数“贴壁”指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 染色：常用结晶紫染色、台肦蓝、Giemsa、苏木精、伊红等。细胞计数：显微镜进行观察和拍照，随机选取若干个视野计数细胞。一般35个，选择
13、尽可能多的视野。间接计数法 当穿过细胞过多无法通过计数时应用，常用MTT、荧光试剂检测、结晶紫检测。,注意：1.有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。2.为了让实验结果更明显，可先用无血清培养基让细胞饥饿1224h，再进行实验。3.下层培养液和小室间避免产生气泡。,常用公司产品及价格：Costar、Corning、BD生产的小室Coster：24孔板的transwell：456元,8m。Corning：cat No.3422.6.5mm transwell with 8.0um prore,48,950元。平均每个2
14、0元。BD价格：240元一块（6.5um,24孔,12instert）Millipore：8m的50个1760元,0.4m，2000,一次性。国产：30块一个。,常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和型胶原，生产厂家有BD、美国Collaborative Rsearch公司等。价格约1500左右。若购买的小室已经铺好基质胶，就不需购买Matrigel。,4）肿瘤转移实验,把试验动物体内试验与肿瘤细胞体外培养结合，研究肿瘤细胞的生物学特点，用于筛选具有不同转移能力的肿瘤细胞亚群，体外分离高转移特性瘤株并研究其特性。,参考书籍：1.司徒镇强，吴军正主编。细胞培养世界图书出版社2.刘建文主编。药理试验方法学新技术与新方法。化学工业出版社,
