Transwell侵袭实验全面总结.docx

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1、Transwell侵袭实验全面总结第节概念这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。1. Transwell trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是 一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这 是一种膜滤器(Membrane filters)，也可认为是一种有通透性的支架(permeable suppo rts)。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小 室(Transwell chamber，Transwell

2、 insert)，其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不 同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需 要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子 其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.112.0口m，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane)。下图是个Transwell装置的纵切面将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液， 下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯

3、膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚 碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细 胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里 主要谈几种大家常用的实验：(1) 共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要 细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0pm以下孔径。常用0.4、3.0pm。我们实验室用的是0.4口m。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌

4、或代谢产生的物质对细胞A的影响。（2）趋化性实验可用5.0、8.0、12.0口m膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量 可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分 泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。 趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因 子对细胞的趋化作用。（3）肿瘤细胞迁移实验常用8.0、12.0顷膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。（4）肿瘤细胞侵袭实验常用

5、8.0、12.0口m膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。transwell侵袭实验，其实原理简单地说就是用一层膜将高营养的培养液和低营养的培养液 隔开，细胞放在低营养的培养液里，为了找吃的，细胞会往高营养的培养液里面跑，但是有 膜挡着，所以要穿过膜才行。我们在膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，于是细胞要把 基质消化了才可以从低营养的培养液跑到高营养的培养液里面，最后我们检测高营养的培养 液里细胞量就可以知道细胞的侵袭能力了，大概原理就是这样的2.肿瘤细胞侵袭模型用于研究肿瘤细胞侵袭能力的肿瘤细胞侵袭模型有如下几种（引自司徒镇强细胞培养）:2. 1体内癌细胞侵袭模型2. 1. 1皮下移植侵袭模型2

6、. 1. 2肌肉内移植侵袭模型2. 1. 3腹腔内移植侵袭模型2. 1. 4小鼠肾包膜下移植侵袭模型2. 1. 5鼠睾丸包膜下移植侵袭模型2. 1. 6小鼠耳廓皮下移植侵袭模型2. 1. 7鼠爪垫皮下移植侵袭模型2. 1. 8视网内界膜侵袭模型2. 2体外癌细胞侵袭模型2. 2. 1体外静止器官培养法2. 2. 1. 1半固体培养基单细胞器官培养法2. 2. 1. 2液体培养基单细胞器官培养法2.2.2 半体外半体内器官培养法2. 2. 3单层细胞器官培养法2. 2. 4瘤细胞球体器官培养法2. 2. 4. 1静止球体器官培养法2. 2. 4. 2旋转摇动球体器官培养法2. 2. 5单层细胞侵

7、袭实验模型2. 2. 6 Transwell侵袭小室测定法可见，Transwell与侵袭实验之间并不能划等号，Transwell有多种应用，侵袭实验也有多 种方法。所谓Transwell侵袭实验，其实是指将Transwell这一技术应用于肿瘤细胞侵袭研 究的一种实验。由于其简单易行、重复性好，因而得到了越来越广泛的应用，但不能认为研 究肿瘤侵袭只有Transwell 一种方法。第二节Transwell侵袭实验1实验用品: Transwell 小室：多种厂家可提供，论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室，我们实验室用的是Chemicon 公司的 ECM550 系歹U，另有 B

8、oyden chamber、Millipore 公司的 millicell 和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincerto这些厂家提供的小室，有的已铺好基质胶，买来就可以用，很方便，但也比较贵，我们实验 室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的，质量很好，但是非常贵，24孔板 配套的小室，每个价格约130元，不推荐给大家。BD也有已包被好的，价格不清楚。Cos ter和Corning公司生产的小室，是论坛里比较常用的，好像是要自己铺胶，但据说每个小 室成本只有40左右，应该比较适合中国国情。下面是一些战友提供的价格，具体建议大家联系代理商咨询。linanping1979战友提供

9、的价 格：coster的24孔板的transwell的价格是456元RMB，叩m，用于肿瘤的侵袭实验。ic eyxy战友提供的价格：Millipore的8pm的50个1760RMB，0.4pm的2000多，是一次性的。梅林战友提供的BD价格：240RMB 一块（6.5um，24孑L，12instert），好像是没胶 的。liguofan 说国产的 boyden30 块一个。jjyy 提供的价格是：corning cat No.3422. 6.5m m transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950 人民币

10、不 到。平均每个20元不到。Transwell小室按照公司的要求，都是一次性使用的。不过其实洗洗泡泡还是可以重复用的。 我用的Chemicon公司的ECM554，用完后擦去基质胶，再用胰酶和75%酒精泡，可以把 膜洗得很干净，用前用紫外里外都照30min。sword01战友提供的处理方法：用棉签轻轻擦 去胶和反面细胞，清水冲洗，超声清洗，低挡，30min，清水3x5min，蒸馏水3x5min，室 温凉干，用前紫外线小室正面3h，反面6h，微波，低火10minx2。因为我买的是铺好胶的，所以没买Matrigel，二次利用的小室只用来做不需要铺胶的迁移实 验。以前的Chemicon ECM550系

11、列，膜很结实，擦不坏，可以反复用很多次，但现在的 膜已经改用一种很薄很脆的材料，一般只能重复用一次，真黑啊！很多战友说Costar和C orning也是可以重复用的，大家可以试试。另外，根据论坛战友提供的信息，osmonic公司有专用的膜出售，鼎国生物代理。Transwe ll小室用过后，可把原来的膜切下，贴上osmonic公司的膜，这样又可以用了，不过我没用 过，有兴趣的可以试试。maojianwen战友的使用方法：trasnwell小室做一次后，将原来 的膜去掉，重新泡酸，泡酒精，使用前照紫外，然后用女士用指甲油（注意用无色较稀的） 将osmonic公司的膜贴上，剪掉多余的边缘。再照紫外。

12、 上层培养液：上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2% BSA。 细胞：值得注意的是，有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。建议实验前先用酶谱法检 测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。如果不清楚细胞MMPs的表达情况，就盲目进 行Transwell侵袭实验，可能会造成不必要的浪费，一次Transwell侵袭实验花钱少则数百， 多则数千，并不是笔小数目，还是小心为妙。另外，为了让实验结果更明显，可先撤血清让 细胞饥饿1224h，再进行实验。 基质胶：常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和W型胶原，生产厂家有B D、美国C

13、ollaborative Rsearch公司等。CaoY战友的帖这么说的：Matrigel是BD公司生 产的，是一种细胞外基质，4度时是液体，在37度会逐渐凝固成胶状，不可逆。同样的东 西在sigma叫ECM。zhangyong1036战友提供的价格：BD公司的matrigel 1500左右。 如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel就不需要购买了。 下层培养液：下层常用含5%10% FBS的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可 适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子，有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋 化因子，但个人认为，FBS仍是最合适的。 细胞培养板：

14、常用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常用。 细胞培养板没什么特殊要求，普通的细胞培养板就可以。但要注意，细胞培养板应当与购买 的Transwell小室相配套。 此外，膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白（fibronectin，FN，Sigma有售），这样做的目 的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上，也可用胶原（collagen）或明胶（gelatin）。很多 战友认为这不是必须的，而且我也是不涂的，细胞照样贴壁很好。如果贴壁不好的话可以试 试看。linanping1979战友认为，如果培养时间很长（24h），细胞还是会掉到下室里面去， 所以有条件的话，

15、最好还是在膜下层涂上FN。另外，值得一提的是，膜下层涂上FN还有 一定的趋化作用。zhangyong1036战友提供的价格：sigma的fibronectin，价格在1500 左右。2.步骤2. 1 Transwell小室制备2.1.1无基质胶Transwell小室制备 包被基底膜：用50mg/LMatrigel 1: 8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4C风干。如果需要 在下室面铺FN的话，可将200ul枪头的尖端剪掉，吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶 原（collagen）的话，一般配成0.5mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。 水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入5

16、0ul含10g/LBSA的无血清培养液，37C，30min。另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel （3.9 ug/ul） 60-80W （注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好），置37C 30min 使Matrigel聚合成凝胶。2. 1. 2有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300pl预 温的无血清培养基，室温下静置1530min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。2. 2制备细胞悬液 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿1224h，进一步去除血

17、清的影响。但这一步并 不是必须的。消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗12遍，用含BSA的无血清培养 基重悬。调整细胞密度至110x105,个人认为不要超过5x105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量 过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话， 可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内 还要有一定量的细胞存在。个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如 果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准

18、确，尽量保证 对照组和处理组细胞密度一致。2. 3接种细胞 取细胞悬液100 200pl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室 对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200叫。 24孔板下室一般加入500含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同 要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一 旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出 现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 培养细胞：常规培养1248h （主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除

19、了要考 虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我 选择的药物浓度是用MTT筛选出的72h的IC50O用这个浓度处理细胞，24h内对细胞增殖 并无明显抑制，但24h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细 胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起， 还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MM

20、Ps储存，短时间内可 能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达， 到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点 研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形 态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象。在培养过程中， 膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后， 膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞 后12h把培养板从培养

21、箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。2. 4结果统计检测穿过的细胞数有两种方法：2. 4. 1直接计数法2. 4. 1. 1“贴壁”细胞计数这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。如下图:通过给细胞染色，可在镜下计数细胞: 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞。 染色：常用的染色方法有结晶紫染色、台盼蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红 染色等。个人推荐采用0.1%结晶紫染色，这种方法有如下优势：（1）不需要固定细胞，直接染色 即可。（2）配制简单方便。（3）染色后可以用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来， 洗脱液可在酶标仪上570nm测其OD值，间接反

22、映细胞数。个人认为这是结晶紫染色最大 的优势所在。因为，虽然经过准确的细胞计数，往往穿过膜的细胞数仍难以准确控制，可能 某一批实验穿过的细胞会特别多，以致细胞成堆，这种情况下就难以计数了，这种情况下就 可以用醋酸脱色后用酶标仪检测。使用结晶紫染色要注意，染色前要将膜风干，否则可能会 染不上。 细胞计数：我们使用的是Leica DC 300F正置显微镜进行观察和拍照，把Transwell 小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。也有不少人用手术刀将膜切 下后染色，再贴在玻片上，滴二甲苯，再盖上盖玻片，就可以长期保存，但是这样做小室就 成了一次性的了，未免有点浪费。取若干个视野计数

23、细胞个数。论坛里一般采用35个视野，也有人用10个，都是随机选 取，个人认为这样选择的视野带有很大的偶然性，也会掺进人为影响，特别是计数视野较少 的时候。我选取16个视野，不是随机选择，而是有固定的位置。我们使用的显微镜所看到 的视野的直径刚好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直径的1/4。如图，蓝色部分表示膜的大小，白色圆形表示视野的大小，绿色方形则表示拍照时所能拍下 的视野的中心部分。这样，每个小室都拍摄如下图的16个视野进行计数，这样得到结果是! J 。:X %wLJBFj比较客观和准确的。-2. 4. 2间接计数法间接计数法主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确

24、的细胞数所采用的方法，与常 用的MTT实验是同样的原理。2. 4. 2. 1 MTT 法 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 24孔板中加入500口1含0.5mg/ml MTT的完全培养基，将小室置于其中，使膜浸没在培 养基中，37r 4h后取出。 24孔板中加入500口1 DMSO,将小室置于其中，使膜浸没在DMSO中，振荡10min，使甲臜充分溶解。取出小室，24孔板于酶标仪上测OD值。2. 4. 2. 2荧光试剂检测这类方法一般是与Transwell小室一起出售的，其原理与MTT法类似，是用一种荧光染料 染细胞，再将细胞裂解，检测荧光值。Chemicon的ECM554即属于这类。2. 4.

25、2. 3结晶紫检测上文已说过，这里不再赘述，原理与MTT法也是类似的。但结晶紫染色还有个优点，就是 染色和脱色的过程并不影响膜上细胞，在脱色后还可重新染色。2. 4. 2. 4 “非贴壁”细胞计数由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系，有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上，而是掉进下室。如下图:第三节Transwell的其他应用的实验步骤1. Transwell肿瘤细胞迁移实验过程与Transwell侵袭实验基本一致，不同的只是不需要铺Matrigel。个人认为，由于没有 基质胶的阻挡，细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快，所以细胞量要更大。我做侵袭实验 的细胞密度是1x105，而迁移实验的密度是1x

26、106。另外，下层培养液的FBS浓度也可适 当下调，我做侵袭实验的浓度是5%，迁移实验的浓度是2.5%。2. cathywxy战友的Transwell上皮细胞培养步骤做了一段时间的原代细胞培养，把经验拿出来跟大家分享一下吧，请大家共同探讨：(1) 将雄性wistar大鼠麻醉，开胸，将气管取出，置于4C含0.1%胰蛋白酶XIV (Sig ma)，100 U/ml 青霉素和 100ug/ml 链霉素(Gibco-BRL)、无 Ca 2+、Mg 2+，无血清 的 MEM。(2) 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁，将所得溶液离心后得到游离细胞。(3) 离心后立即用新鲜的上述MEM溶液(含10%胎牛血清)清洗

27、3次，以中和胰蛋白酶，再用含5%胎牛血清、100U/ml青霉素和100 ug/ml链霉素的LHC-8 medium (Biof luids)冲洗一次。(4) 冲洗过后，将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力，若存活率大于90%，则将细胞以10 6/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12 mm SNAPWELL,Costar),以 37C5%CO2-95% 空气含 5% 胎牛血清（Gibco-BRL） and 100 U/ml 青霉素 and 100ug/ml 链霉素的LHC-8 medium孵育610天。（5）孵育后，经测定跨上皮电阻在10002000Q之间，即可用于电生理试验。显微镜下气管上皮

28、细胞形细胞呈铺路石状，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层 细胞3. metastasis战友的Transwell B16细胞的体外迁移实验我以前用costar的Transwell做过B16细胞的体外迁移实验，具体是这么做的：首先把Tr answell 倒置，在 Transwell 的 PVPF 膜（0.8 um）的下表面涂一层 fibronectin （10 ug/ml， 50ul ），37度2小时，PBS洗一遍后，放入预先每孔加有600ul的培养基（含10%血清） 的24孔板内，后在Transwell的内室加入细胞（100ul，用含0.1%血清的培养基稀释好自 己所需密度），放入培养

29、箱，12-18小时后，取出Transwell，用棉签擦去PVPF膜靠近内 室那一面的细胞，另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟，结晶紫染色20分钟，用清水洗3 遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数。4. mci战友的内皮细胞HMEC-1迁移实验1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后，上室加入1 00pl用serum-free MCDB131稀释的5x104/孔的HMEC及不同浓度的药物，下室加入0.6ml serum-free的MCDB131培液及20%FCS刺激迁移，同时设置相应阴性及阳性对照， 置于CO2培养箱中作用8小时，然后弃去孔中培液，用90%酒精常温固定30分钟，0.1% 结晶紫常温染色10分钟，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜（Olympus， DP50， Japan）0下观察并拍照，最后用10%乙酸100叫孔抽提10分钟，于600nm处 测定OD值。抑制率计算公式为：抑制率（%）=【（OD值给药组-OD值无刺激阴性对照） / （OD值不加药阳性对照-OD值无刺激阴性对照）】x100%。