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1、第三节 蛋白质的共价结构(一级结构）,一 肽与肽键的结构二 肽的物理和化学性质三 天然存在的活性肽四 蛋白质一级结构的测定 蛋白质的一级结构与生物功能,一级结构:多肽链的氨基酸序列,基本要求1.肽的结构特点、基本性质2.蛋白质一级结构测定方法3.一级结构与生物功能关系，有关典型例子,一 肽与肽键的结构：肽（peptide）：aa的线性聚合物,也称肽链。肽键（peptide bond）：连接多肽链主链中氨基 酸残基共价键二肽：2个aa以肽键相连寡肽(oligopeptide)：含几个到十几个aa的肽链多肽(polypeptide)：含20个以上aa的肽链环肽,一 肽与肽键的结构：氨基酸残基（am
2、ino acid residues）肽链的极性 N-端（左）、C-端（右）多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端。另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。氨基酸序列是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。肽基(peptide group):也称肽单位,肽链中的酰氨基(-CO-NH-),（酰氨键）肽键：AA间脱水后形成的共价键,肽的命名 Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸（五肽）,Leu-Ala-Tyr-Gly-Ser?,肽,甘氨酸残基,主干链:N-C-C-N-C-C-N-C-C-N-C-C-N-C-C,肽,肽链极性
3、,由CO和NH构成肽键的四个原子和与之相连的两个-碳原子构成的刚性平面,肽平面：也称肽基平面、酰胺平面。,肽平面的形成 见p164图42,肽键的C和N均为sp2杂化，有部分双键的性质，相关的6个原子处于共平面,肽平面：也称肽基平面、酰胺平面。,肽平面的形成 见p164图4-2,肽平面结构特征:,肽键长=1.33A，具部分 双键性质，不能自由旋转肽平面上的六个原子 倾向于共平面，因此肽平面具有刚性在肽平面中C=O与NH 或两个C呈反式排布。除Pro外，NC（）和CC（）都是单键，可以绕键轴自由旋转，其旋转角度分别用和表示，称为二面角（dihedral angle）,N,C,O,H,C,C,115
4、.6,121.9,123.2,119.5,肽平面示意图,肽平面：也称肽基平面、酰胺平面。肽键的平面性质在肽链折叠成三维结构中是很重要的。,（二）肽的理化性质,1 酸碱性：肽链中末端-羧基的pKa值比游离氨基酸中的大；末端-氨基的pKa值比游离氨基酸中的小。肽的等电点计算需先分别判断各解离基团的带电荷情况，再统计净电荷的量（P166表4-6）。,（二）肽的理化性质,.化学反应:化学反应与氨基酸类似，同时，由于肽键的存在,肽可以进行双缩脲反应。茚三酮反应:双缩脲反应：肽和蛋白质特有，而为氨基酸所没有的一种颜色反应。,（二）肽的理化性质,.化学反应:,双缩脲（H2NOCNHCONH2）,（二）肽的理
5、化性质,.化学反应:,双缩脲,双缩脲与铜离子的络合物,双缩脲在碱性溶液（NaOH）中，能与铜离子（Cu2+）作用，形成紫色络合物，该反应即双缩脲反应。,（二）肽的理化性质,.化学反应:,由于多肽和蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应,多肽或蛋白质与铜离子的络合物部分结构,（二）肽的理化性质,3 旋光性质：小肽：各氨基酸旋光度之和 长肽和蛋白：不是简单加和,（三）天然存在的活性肽,类别：肽类激素、肽类抗生素和肽类毒素,实例：短杆菌肽（抗生素）谷胱甘肽：-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸 GSH（还原型）：三肽 GSSG（氧化型）：六肽 脑啡肽：五肽，神经系统
6、 鹅膏蕈碱：环八肽 鹅肌肽（-Ala-1-甲基-his)二肽 肌肽（-Ala-his)二肽,（三）天然存在的活性肽,GSH（还原型）三肽,GSSG（氧化型）六肽,Glu-Cys-Gly|S|S|Glu-Cys-Gly,生理功能,解毒作用 与毒物或药物结合，消除毒性参与氧化还原反应保护巯基酶的活性 使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用,L-Aspartyl-L-phenylalanine methyl ester,阿斯巴甜Aspartame,天冬酰胺苯丙氨酸甲酯,一种比蔗糖甜200倍的甜味剂,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Me
7、t-COO-Met-脑啡肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Leu-脑啡肽,均为9肽，仅2个氨基酸有差别，生理功能差别极大。,抗革兰氏阳性菌治疗化脓性病症,蛋白质 氨基酸残基数在50个以上，具有特定空间结构的肽。多肽 氨基酸残基数在50个以下，无特定空间结构的肽。,蛋白质与多肽的区别,三、蛋白质一级结构的测定,测定的战略：片段重叠法,一级结构是研究高级结构的基础；从分子水平阐明蛋白质的结构与功能的关系；为生物进化理论提供依据；为人工合成蛋白质提供参考。,测定蛋白质一级结构的主要意义：,二硫键的数目和位置,蛋白质的一级结构(Primary structure),组成蛋白质
8、的多肽链数目,多肽链的氨基酸顺序,1 测定多肽链的数目,2 拆分多肽链,3 断开多肽链内的二 硫键,4 测定每一肽链的氨 基酸组成,5 鉴定多肽链的N-末端和C-末端,6 裂解多肽链为较小的肽段,7 测定各肽段的氨基酸序列,8 重建完整多肽链的一级结构,9 确定二硫键的位置,相对分子量的确定,待测样品纯度鉴定97以上,准备工作,(一)策略,准备工作（一）：样品的分离纯化和纯度鉴定 纯度97%检测蛋白质样品纯度的方法：（1）电泳（2）层析（3）N-末端氨基酸的测定（4）等电点沉淀（5）纯化至恒定的比活,准备工作（二）：确定相对分子量 误差10%（1）凝胶过滤（2）沉降分析法（3）SDS-PAGE
9、（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）,分子总的相对分子质量,每个亚基的相对分子质量,测定要求,A.纯：97%B.分子量C.亚基数量D.测定氨基酸组成；计算每种氨基酸的个数E.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量,1、测定蛋白质分子中多肽链的数目测定末端AA的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系确定多肽链的数目,（二）测定步骤,2、多肽链的拆分 多条多肽链组成的蛋白质分子，必须拆分,2.多肽链的拆离 P171 1).亚基拆分:PH改变:PH10;PH3 强变性剂：脲（8M）；盐酸胍（6M）高浓盐 2).二硫键拆分 氧化:过甲酸，不再重新生成-S-S-还原:DTT；巯基乙醇 加碘乙酸等烷基化试剂封闭SH 烷基化
10、试剂：碘乙酸，碘乙酰胺，环乙烯亚胺 3).肽链分离和鉴定 分离:层析 电泳 鉴定:SDS-PAGE；N-末端分析,寡聚蛋白质：多肽链以非共价键连接血红蛋白（四聚体）、烯醇化酶（二聚体）8mol/L尿素 6mol/L盐酸胍,多肽链以共价键连接胰岛素：过甲酸氧化-巯基乙醇还原,1).亚基拆分:,2）二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联 8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下 过量的-巯基乙醇处理 二硫键还原为巯基 烷基化试剂保护巯基，防止重氧化,-S-S-共价交联肽链的拆分,氧化法,还原法,3.肽链aa组成的测定：1)蛋白水解:酸解法；碱解法；5.7N恒沸HCL Trp100%被破坏 酸解：
11、Pr溶液 105-11020-72h 二硫键解离 Asn Gln Asp Glu Ser Thr Tyr Lys部分破坏 2)aa定性和定量：定性:纸层析；薄层层析；高压纸电泳 定量：柱层析(离子交换原理),3、测定各多肽链的AA组成并计算出氨基酸成分的分子比,末端氨基酸：N-端A(amino-terminal)、C-端AA最重要的是N-端AA分析法,二硝基氟苯（DNFB）法,Sanger法：2,4-二硝基氟苯与N-端的游离氨基作用，生成 二硝基苯衍生物（DNP）.,酸性条件下水解，黄色DNP-氨基酸，乙醚抽提分离；色谱法鉴定。,丹磺酰氯与N-端AA的游离氨基作用，丹磺酰-AA优点：丹磺酰-A
12、A强荧光，检测灵敏度达10-9mol,丹磺酰氯法,C-端AA分析法多肽与肼在无水条件下加热，C-端AA即从肽链上解离其余的AA生成肼化物肼化物与苯甲醛缩合成不溶于水的物质与C-端氨基酸分离,肼解法,氨肽酶：肽链外切酶，从多肽链的N-端逐个水解根据不同的反应时间，水解出AA种类和数量确定N-末端残基顺序亮氨酸氨肽酶,氨肽酶法,C-端逐个水解 根据不同反应时间测出酶水解释放的AA种类和数量 确定C-末端残基顺序 A,B,C，Y；羧肽酶A：水解除Pro,Arg和Lys外的C-末端氨基酸残基 B：水解Arg和Lys为C-末端的残基,羧肽酶法,酶解法胰蛋白酶 水解Lys Arg羧基形成的肽键。糜蛋白酶
13、水解Tyr Phe Trp羧基形成的肽键。胃蛋白酶 水解肽键的两侧AA均为疏水性AA.金黄色葡萄球菌菌蛋白酶 水解Glu Asp羧基形成的肽键。梭状芽孢杆菌蛋白酶 水解Arg羧基形成的肽键。羧肽酶 从羧基端开始逐一水解AA的酶氨肽酶 从氨基端开始逐一水解AA的酶,化学法：(Cyanogen bromide)溴化氰水解法：选择性地降解Met的-COOH形成的肽键,7、测定每个肽段的氨基酸顺序,Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法：N-端分析法。特点：重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一标记解离,8、确定肽段在多肽链中的次序,利用两套或多套肽段的AA顺序彼此交错重叠拼凑出整条多肽链的氨基酸
14、顺序,9、确定原多肽链中二硫键的位置,胃蛋白酶处理未断开二硫键的多肽链双向电泳分离各肽段，过甲酸处理，分析每个肽段组成及顺序，同其它分析肽段的方法进行比较，确定二硫键的位置,10、蛋白质序列数据库,1.欧洲生物信息中心研究所和瑞士生物信息研究所共同管理的SWISS-PROT有10多万条肽链的信息；,2.美国国家生物医学基金会主持的PIR有近30万条肽链的信息，但多数由核酸信息翻译而来，有些未经严格检验,3.美国政府支持的Gen Bank和欧洲的 EMBL有大量的基因序列信息，从其阅读框可以得到蛋白质序列的不少信息,四、Pr 的AA序列与生物功能,（一）同源Pr的物种差异与生物进化,同源蛋白质（
15、homologous protein）,进化上相关的一组蛋白质在不同物种中行使着相同功能的蛋白质不同物种：长度相同或相近,细胞色素C的物种差异,细胞色素C：含铁线粒体蛋白质，生物氧化中传递电子,不变残基（invariant residue）：重要残基，决定蛋白质特殊生物学活性,可变残基（variable residue）两个物种同源蛋白质差异数与进化差异程度成正比,104个氨基酸12，500 D,一级结构是空间构象的基础,天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,一级结构中“关键”部分相同,其功能相同,一级结构不同，生物学功能各异（催产素与抗利尿激素）,
16、一级结构变化与疾病的产生-分子病如：镰刀状红细胞性贫血 Hb：6位Glu Val,（二）同源蛋白质具有共同的进化起源,1.氧合血红蛋白,鲸精子肌红蛋白,2.丝氨酸蛋白酶类:显示明显的序列同源性,该酶类活性中心的Ser残基起关键作用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶凝血酶、纤溶酶序列同源性对底物偏爱不同,3.功能差异很大的蛋白质,卵清溶菌酶（lysozyme）-乳清蛋白（lactalbumin）功能差异很大三级结构很相似 也可能具有共同的祖先,（三）血液凝固与AA序列的局部断裂,血液凝固：凝血因子作用下，可溶性血纤蛋白原转变为不溶性的血纤蛋白网,12种蛋白质凝血因子有7种是丝氨酸蛋白酶,五、肽与蛋白质的人工合成,自学,END,
