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1、第二章 色谱法引论,Generalization of chromatograph analysis,2.1 概述2.2 色谱流出曲线及有关术语2.3 色谱基本理论2.4 分离度,2.1 概述,一 色谱法简介二 色谱发展历史三 色谱的分类四 色谱法的特点,经典的分离方法：沉淀、蒸馏和萃取；现代分析中，大量采用色谱和电泳分离方法。迄今为止，色谱方法是最为有效的现代分离分析手段！,2.1概 述,色谱法是一种物理化学分离方法。将这种分离方法与适当的检测手段相结合，应用于分析化学领域，就是色谱分析法。,一、色谱法简介,色谱法早在1906年由俄国植物学家MRswett(茨维特)使用CaCO3粉末作为，石
2、油醚作为,玻璃管作为，分离植物中色素时发现并命名的“色谱法”(chromatography),色谱法是一种分离技术，其研究对象是复杂的混合物质。,固定相,流动相,色谱柱,二、色谱法的历史,俄国植物学家茨维特Tsweet 首先将这种层析现象用于分离植物色素红萝卜素、叶黄素和叶绿素A、B，并将这种方法命名为色谱法 液-固色谱（是最先创立的色谱方法）20年后（1931）Kuhn（库恩）为了证实蛋黄中的叶黄素是植物叶黄素与玉米黄质的混合物，参考了Tsweet 的论文并采用的色谱法进行其研究工作（吸附色谱）1938年，Martin（马丁）和Synge（辛格）采用水分饱和的硅胶为固定相，以含有乙醇的氯仿为
3、流动相分离乙酰基氨基酸并且提出了色谱塔板理论 分配色谱,1951年，Martin 和James采用气体作为流动相，以自动滴定仪作为检测器分析脂肪酸 气相色谱法。建立形成色谱学理论中有着重要地位的塔板理论和Van Deemter方程，以及保留时间、保留指数、峰宽等概念。1952年，A.J.P.Martin和 R.L.M.Synge获得了诺贝尔化学奖。在他们获得诺贝尔奖的论文中还指出“采用气体代替液体作为流动相分离各类化合物的可能性是存在的。”“如果流动相用气体来代替，对分离更有好处”，“使用非常细的颗粒填料和柱的两端施加较大的压差，应能得到较小的理论塔板商”,1957年，Golay又提出了使用毛
4、细管柱代替填充柱可获得极高的分离效率毛细管气相色谱法 从此，气相色谱法得以蓬勃发展。气相色谱学的诞生及其获得广泛的应用使色谱学逐渐成为分析化学的一个重要分支学科,1960年代，为了分离蛋白质、核酸等不易汽化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。1960年代末科克兰等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。,1971年科克兰等人出版了液相色谱的现代实践一书，标志着高效液相色谱法(HPLC)正式建立。,1937-1972年，15年中有12个Nobel奖是有关色谱研究的！,三、色谱的分类,1.色谱过程中两相的物理状态分类 2.色谱分离过程的作用原理分类 3.
5、固定相的使用分类,1.色谱过程中两相的物理状态分类,3）超临界流体色谱(SFC),2.色谱分离过程的作用原理分类,不同组份在固定相的吸附作用不同,不同组份在固定相上的溶解能力不同,不同组份在固定相（离子交换剂）上的亲和力不同,不同尺寸分子在固定相上的渗透作用,3.固定相的使用的形式分类,纸色谱法 paper chromatography薄层色谱法 thin layer chromatography,四、色谱法的特点,（1）分离效率高 复杂混合物，有机同系物、异构体，手性异构体。（2）灵敏度高 可以检测出g/g(10-6)级甚至ng/g(10-9)级的物质量。（3）分析速度快 一般在几分钟或几十
6、分钟内可以完成一个试样的分析。（4）应用范围广 气相色谱：沸点低于350的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析和制备。,2.2 色谱流出曲线及有关术语,一、色谱分离过程及流出曲线二、色谱相关术语三、色谱流出曲线的意义,一、色谱分离过程及流出曲线,1、色谱分离过程,混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应,色谱分离基本原理：使用外力使含有样品的流动相（气体、液体或超临界流体）通过一固定于柱或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。样品中各组份在两相中进行不同程度的作用。与固定相作用强的组份随流动相流出的速度慢，反之，与固定相作用弱的组份随流动相流出的速
7、度快。由于流出的速度的差异，使得混合组份最终形成各个单组份的“带(band)”或“区(zone)”，对依次流出的各个单组份物质可分别进行定性、定量分析。,由检测器输出的信号强度对时间作图，所得曲线即色谱流出曲线，也称色谱图。,2、色谱流出曲线,1、色谱峰（peak）：当某组分从色谱柱中流出时，检测器对该组分的响应信号随时间变化所形成的峰形曲线。,2、基线（baseline）：在正常操作条件下（操作条件稳定后），仅有流动相通过检测器时，仪器记录到的一条平行于横轴的直线。图中CD所示。,2)基线漂移（baseline drift）：基线随时间定向的缓慢变化。,1)基线噪声（baseline noi
8、se）：由各种因素引起的基线起伏。,3、峰高（peak height）：色谱峰顶点与基线的距离。以h表示，图中AB。,二、色谱相关术语,1)标准偏差（standard deviation）：0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半，图中EF的一半。2)半峰宽（peak width at half-height）Y1/2：峰高一半处的峰宽，图中GH。Y1/2=2.35 3)峰底宽(peak width at peak base)Y：色谱峰两侧拐点上切线在基线上的截距，图中IJ。Y=4,4、区域宽度（peak width）：用于衡量柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。通常有三种表示方法：,通常表示区域
9、宽度,1）死时间(dead time)tM：不被固定相吸附或溶解的组分（如空气、甲烷）从进样到出现其色谱蜂最大值所需的时间，图中OA所示。tM也是流动相流经色谱柱所需的时间。据 tM 可求出流动相平均流速,5、保留值R（retention value）：是试样各组分在色谱柱中滞留时间的数值，它反映组分与固定相间作用力大小，通常用保留时间和保留体积表示。它是色谱定性分析和色谱过程热力学特性的重要参数。,3）调整保留时间(adjusted retention time)t R：扣除死时间后的保留时间，它是组分在固定相中的滞留时间。图中AB所示，即t R=tR tM t R 反映了组分在色谱过程中，
10、与固定相相互作用所消耗的时间，是各组分产生差速迁移的物理化学基础。,2)保留时间(retention time)tR：指某组分通过色谱柱所需时间，即试样从进样到出现峰极大值时的时间，图中所示。在一定色谱体系和操作条件下，任何一种化合物都有一个确定的保留时间，这是色谱定性的依据。,4）死体积(dead volume)VM：色谱柱内载气所占的体积。,6）调整保留体积（adjusted retention volume)V R：扣除死体积后的保留体积。,5）保留体积(retention volume)VR：指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。,其中，qv,o为柱出口的载气流速
11、（mLmin-1),7）相对保留值（relative retention time）r21：组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比。,注意：1、r21只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长L、填充情况及流动相流速无关，因此，在色谱分析中，尤其是GC中广泛用于定性的依据！,2、r21亦可用来表示固定相（色谱柱）的选择性。r21值越大，相邻两组分的tR相差越大，分离得越好。r211，两组分不能被分离。,选择性因子,三、色谱流出曲线的意义（重要信息）：色谱峰数样品中单组份的最少个数；色谱保留值定性依据；色谱峰高或面积定量依据；色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标；色谱峰间距固定相或流动
12、相选择是否合适的依据。,2.3 色谱基本理论,一、描述分配过程的参数二、色谱分离的基本理论塔板理论速率理论,一 描述分配过程的参数 分配系数(Distribution constant,K),分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的，它是每一个溶质的特征值，与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。,在气相色谱中与两个变量有关：固定相和温度在液相色谱中与三个变量有关：固定相、流动相和温度。,描述组分在固定相和流动相间的吸附-脱附过程或溶解-挥发过程（分配）的参数，称为分配系数。,2.分配比(Retention factor or capacity factor,容量因子，容量比，k)在一定温度和压
13、力下，组分在两相间的分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。,它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。,某组分的k值可由实验测得，它等于该组分的调整保留时间与死时间的比值，即,3.K、k与选择因子的关系：,两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。,称为相比，它也是反映色谱柱柱型及其结构的重要特性。对填充柱，=635；对毛细管柱，=501500。,结论：K 或 k 反映的是某一组分在两相间的分配，它们都与组分及两相的性质有关，并随柱温、柱压的变化而变化。K与两相体积无关，而k则随固定相的量而改变。如果两组分的K或k值相等，则=1，两个组分的色谱峰必将重合，说明
14、无法实现分离。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。,塔板理论（Plate theory),1.塔板理论的假设2.理论塔板高度和理论塔板数3.有效塔板高度和有效塔板数4.塔板理论的不足,1952年，Martin 和Synge提出。用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。,分馏塔：在塔板上多次气液平衡，按沸点不同而分离。,塔板是从精馏塔中借用的，是一种半经验理论，但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。,色谱柱：组分在两相间的多次分配平衡，按分配系数不同而分离。,1.塔板理论的假设,（3）试样开始时都在第0号塔板上，且试样沿色谱柱方向的纵向扩散可
15、略而不计。,（4）分配系数在各塔板上是常数。,（1）在柱内一小段 长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段长称为理论塔板高度H。,（2）载气进入色谱柱，不是连续的而是脉动式的，每次进气为一个板体积。,塔板号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9,色谱流出曲线方程式：,为讨论方便，假设：塔板数为5,进样量：1mg,k=1.,由上述两式知道，理论塔板数n 越多、理论塔板高度H 越小、色谱峰越窄，则柱效越高。,2.理论塔板高度和理论塔板数,理论塔板数：,可见理论塔板数由组分保留值和峰宽决定。,若柱长为L，则每块理论塔板高度H为,柱效方程,通常以有效塔板数neff 和有效塔板高度Heff 表
16、示：,3.有效塔板高度和有效塔板数,塔板高度H与塔片数n在实际工作中的意义,H表示在色谱柱中溶质在流动相和固定相之间达到一次平衡时所对应的柱长，H越小，色谱柱的柱效越高H表示柱效的优点是可以直接比较不同柱长的柱效，因为它是表示在色谱柱中溶质在流动相和固定相之间达到一次平衡时所对应的柱长n则表示在一定长度的色谱柱上，溶质流过时在两相进行平衡分配的总次数。n越大，色谱柱的柱效越高 n大或H小，只表示固定相的分离潜力大，要把这种潜力变为现实还取决于其它的分离条件，在一定的操作条件下，混合物中各个组分的分配系数有差异，分离才能实现，此时，n越大或H越小，分离越好。,4.塔板理论的不足,色谱过程也不是分馏过程，所以塔片理论只是一个半经验的理论，其并没有阐述色谱过程中谱带扩展的实质。塔片理论没有考虑各种动力学因素对色谱柱内传质过程的影响，因此不能解释造成谱带扩张的原因和影响板高的各种因素。塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果。,
