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1、2023血小板在中性粒细胞胞外陷阱交织炎症和血栓形成中的作用血小板在控制出血的起始阶段起着不可或缺的作用，过去几年里大量研究证明血小板也参与宿主的先天免疫。特别是，血小板可以激活中性粒细胞形成中性粒细胞胞外陷阱(neutrophiletracellulartraps,NETs).这种特异性中性粒细胞效应器功能的特征是中性粒细胞将组蛋白和抗微生物蛋白修饰的染色质纤维排出到细胞外空间，并在那里捕获和杀死病原体。到目前为止，血小板和中性粒细胞之间诱导NETS形成的机制和信号通路仍未完全阐明。在几种血栓性病变的疾病中也检测到了NETs,这表明它是中性粒细胞、血小板和血栓形成(也称为免疫血栓形成)之间的
2、中介。NETs内带负电荷的DNA提供促凝表面，特别是NET衍生的蛋白质可以直接激活血小板。来自德国明斯特大学的JarlRoSSaint等人于2022年8月在FrontierSinImmUnOIogy上发表综述PlateletsintheNETworksinterweavinginflammationandthrombosis，讨论了血小板和NETS之间的相互作用，以及影响炎症性疾病进程的潜在威胁。人们更好地了解潜在的分子机制和确定治疗靶点对于提高患者的生存率和改善临床结局至关重要。o4ogyo*AMQMWe202200IO339drwMj2022953L29PlateletsintheNETw
3、orksinterweavinginfIammationandthrombosisAnn-KatrinWienkamp,.LuiseErpenbeckifandanRossaint1*I背景：血小板是无核的小细胞，来源于骨髓中的巨核细胞，是确保损伤部位血管完整性不可或缺的。一个巨核细胞通过前体血小板的伪足延伸片段将数干个新的血小板分泌到血液中。血小板表面表达大量免疫受体，使其能够探测周围环境中病原体入侵和炎症的迹象。TLR参与导致血小板聚集、表面P选择素表达增加、脱颗粒与其他免疫细胞（如单核细胞和中性粒细胞）形成聚集体。血小板的激活启动细胞内信号级联，导致表面整合素的激活、血小板颗粒含量的释放
4、、凝血级联的维持以及其他血小板和免疫细胞募集到形成的凝块中。中性粒细胞是循环中最丰富的先天免疫细胞，也是第一个被募集到炎症组织中的细胞。他们配备了多种武器，主要任务是对抗入侵的病原体并防止传播。中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的形成，最初由Takei等人观察到，后来由Brinkmann及其同事进行了更详细的研究，通过诱捕和杀死病原体来防止病原体传播只是他们的能力之一。像任何其他中性粒细胞的内在效应器功能一样，NETS可以被视为一把双刃剑。NETs主要由DNA组成，与组蛋白和抗菌蛋白混合，由中性粒细胞排出到细胞外空间，为宿主防御服务。然而，组蛋白已被证明会损伤内皮细胞和上皮细胞。颗粒酶，如髓过氧化
5、物酶（MPO）、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）和组织蛋白酶G,具有高度杀菌作用，但也可能损伤邻近组织。血小板还有一个特殊角色，可以诱导和促进NETosis(中性粒细胞的炎性细胞死亡方式)形成。此外，NETs似乎位于免疫和血栓形成的界面，作为血小板聚集的桥梁并参与凝血级联反应。从生理学的角度来看，这是一种重要的机制，血小板和中性粒细胞结合在一起阻止病原体传播，但在心血管疾病和自身免疫中，它也与长期炎症和血栓性失调有关。在这篇综述中，作者将深入研究血小板如何激活中性粒细胞以形成NET,NET如何触发血小板激活以及凝血，以及这种密切的相互作用如何影响炎症事件期间的病程。最后，作者将讨论针对血小板-NE
6、T相互作用的可能治疗方法，并指出该研究领域的未来前景。2、血小板刺激中性粒细胞生成NETosis血小板与中性粒细胞之间的物理相互作用最重要的是由血小板P-选择素和中性粒细胞P-选择素糖蛋白配体1(PSGL-1)介导的，其诱导中性粒细胞上细胞表面整合素的激活如LFA-1和Mac-1,提供了向两个参与者之间更紧密的结合形成过渡的可能性。受体配体介导的血小板-中性粒细胞串扰和随后的激活在以往文献中已进行了广泛的综述，因此不是本综述的主要内容。2.1血小板-中性粒细胞相互作用导致NET形成在过去的20年里，科学界已经从根本上理解了血小板如何刺激中性粒细胞形成NETse主要有两种机制可导致血小板诱导的N
7、ETosis:第一，血小板和中性粒细胞之间的直接细胞-细胞接触和受体-配体相互作用的结果；第二通过血小板衍生的可溶性介质启动（图1）然而，这两种机制的协同作用绝不能被忽视。此外，一些病原体被发现直接作用于血小板从而导致NETs的下游形成（图2）。所有关于血小板体外实验的报道都有一个共同点，那就是必须用生理刺激来激活血小板，因为未激活的血小板通常无法诱导NET的形成。Clark等人在2007年的第一份报告不仅表明活化的血小板可以诱导NETs,而且表明血小板TLR4在败血症期间的NET形成中发挥重要作用。通过其激动剂LPS与血小板TLR4的结合导致血小板活化，增强血小板与中性粒细胞的结合，中性粒细
8、胞脱颗粒，并最终形成NETo观察到的NETs仅在人中性粒细胞与LPS或脓毒症血浆刺激的血小板共孵育后在流动条件下形成。此外，NET结构能够捕获和杀死细菌，表明在败血症条件下血小板介导的NET形成具有高度的生理相关性。Liu等人也证明了这种TLR4血小板轴依赖性，其中单独体外LPS刺激被证明是不够的，并且仅与血小板诱导的NETS结合。尽管这仍然是有争议的，因为也有报道称LPS在无血小板条件下诱导NETosiso在LPS诱导的内毒素血症小鼠模型中血小板-中性粒细胞的相互作用也导致NET的形成，这高度依赖于陷整合素。更具体地说，阻断中性粒细胞中的LFA-1导致体外NET形成的消除，同时，LFA-1小
9、鼠显示出细菌捕获显著减少，这与腹膜感染后更高的细菌传播一致。令人惊讶的是，肝窦中形成的血管内NETS在捕获细菌方面甚至比库普弗细胞更重要、更有效。图1.炎症诱导的血小板介导的NET形成图2.病原体诱导的血小板介导的NET形成。血小板糖蛋白在无菌血小板介导的NET形成中非常重要。在输血相关急性肺损伤（TRALI）的小鼠模型中，注射GPIIb11Ia受体拮抗剂替罗非班显著减少了NET的形成，并保护小鼠免受TRALI的影响。人类血小板不仅在LPS的刺激下，而且在蛋白酶激活受体-1（PAR-1）激动剂、凝血酶受体激活肽（TRAP）和凝血酶的刺激下能够在体外诱导NETs,这表明血小板在无菌环境中诱导NE
10、Ts的可能性，与TLR的参与无关。阻断Raf-MEK-Erk途径也减少了NET的形成，这表明NADPH氧化酶（NADPHox）依赖性血小板在无菌炎症中诱导了NET的生成。此外，DAP12或FcRg的基因消融以及G蛋白偶联受体（GPCR）信号传导的抑制（通过百日咳毒素）阻止了NETs的形成，从而表明该步骤可能需要整合素和GPCR信号传导，2.2血小板源性可溶性介质对NET形成的影响血小板和中性粒细胞之间的串扰不仅取决于受体-配体的结合，而且在很大程度上受到可溶性介质的影响。到目前为止，在NET形成的背景下，血小板和中性粒细胞之间受体配体结合的可有可无性仍然存在争议。使用transwell装置，将
11、ANCA相关血管炎（AAV）患者的血小板与通过膜分离的中性粒细胞孵育，血小板仍然能够在中性粒细胞中诱导NETso有趣的是，AAV患者的血小板不仅表现出更高的P-选择素表面表达，而且TLR9表达也升高，这表明血小板中TLR稳态具有一定的灵活性。据此，CpG寡核昔酸，一种TLR9激动剂，诱导AAV血小板颗粒释放CXCL4,最终导致NETosis0在与CCL5异二聚化后，血小板CXCL4也显示在VILI中诱导NETosisoCXCL4-CCL5异二聚体通过促进中性粒细胞粘附起促炎作用。在这里，用特异性阻断肽破坏CCL5和CXCL4二聚化有效地阻止了NET的形成。在心肌缺血/再灌注损伤的小鼠模型中,阻
12、断CCL5-CXCL4二聚化通过预防NEToSiS额外保留了心脏功能。在用TRAP激活的血小板刺激后，阻断中性粒细胞中的血栓素（TXA）受体有效地减轻了NETosis,说明血小板激活后血小板释放的TXA2参与了NET的形成。此外，人类血小板将一种抗微生物肽bdefensin1（hBD-1）储存在细胞质的颗粒外室中。在感染金黄色葡萄球菌期间，血小板释放的hBD-1有效地抑制了细菌生长f并在人类中性粒细胞中诱导了强大的NET形成。2.3病毒感染中血小板介导的NET形成尽管人们普遍认为，病毒感染可能主要由适应性免疫引起，但不能简单地忽视先天免疫的重要性。例如，在粘液病毒感染后，循环的小鼠血小板粘附在
13、肝窦中的中性粒细胞上，促进NET的形成，从而保护肝细胞免受病毒感染。汉坦病毒和登革热病毒都是病毒性出血热的病原体，它们不仅会引发血小板减少和活化血小板，还会诱导NET的形成。汉坦病毒通过02整合素介导细胞进入，可能诱导整合素信号传导。事实上，研究表明，通过汉坦病毒连接中性粒细胞中的2整合素信号导致人和小鼠中性粒细胞产生RoS和NADPHOX依赖性NETosise由于病毒也会激活血小板，因此很容易推测血小板在汉坦病毒感染后促进或增强NET形成中的作用，但目前文献中没有支持这一假设的报道。登革热病毒（DV）诱导的血小板介导的NET形成主要依赖于C型凝集素受体CLEC5A和CLEC2。尽管CLEC5
14、A的DV激活直接刺激中性粒细胞形成NET,但病毒也激活了血小板上的CLEC2,这导致细胞外小泡(EV)的脱落，促进NET的形成。NETosis是通过EV介导的中性粒细胞上表达的CLEC5A和TLR2的共激活来执行的。在体外和体内DV感染中，观察到P选择素对血小板的上调，但此处未检测P选择素参与触发NETse感染DV的人类表现出NADPHox非依赖性NETosis表型，如血清血浆中的循环NET样本所示。甲型流感病毒颗粒可以通过TLR7被人类血小板识别，流感病毒颗粒确实被血小板吞噬。病毒被血小板吞噬然后导致颗粒补体蛋白C3的释放，这刺激中性粒细胞释放NETso在甲型流感病毒感染的小鼠模型中，血小板
15、向肺部募集和激活明显先于中性粒细胞的募集和激活。针对感染早期的凝血酶生成，以及血小板上最显著的凝血酶受体PAR4,显著降低了血小板活化、中性粒细胞募集和NET生成。这表明凝血酶不仅作为促凝血剂，而且作为促炎信号介质，在病原体入侵期间驱动中性粒细胞激活和随后的NET形成，具有核心作用。2.4血小板HMGB1促进NET形成携带核吉酸、脂质和蛋白质的血小板衍生外泌体可能不仅在促进炎症和中性粒细胞活化方面发挥关键作用，而且在NET形成过程中也发挥关键作用。特别是高迁移率族蛋白B1(HMGB1)蛋白和微小RNA(miRNA)似乎在血小板衍生的外泌体诱导的NETosis中具有重要意义。HMGBl蛋白属于警
16、报素蛋白家族，其释放后可能以TLR-或RAGE(晚期糖基化终产物受体)依赖性方式引发炎症。在肠缺血/再灌注诱导的ALI小鼠模型中，通过TLR4-MyD88途径从坏死性肠细胞诱导的NETosis中释放HMGB1o然而，HMGB1也可以从受刺激的血小板中主动释放，并通过RAGE在中性粒细胞中诱导NETsoHmgbl-/-血小板诱导NETosis的能力受到阻碍，同时，用HMGB1不能刺激Rage-/中性粒细胞进行NETosise当中性粒细胞中的自噬被抑制时，HMGB1刺激后的NET形成过程也被消除。有多篇文献报道了自噬信号通路和NETosis之间的联系，据推测，自噬使中性粒细胞倾向于NET的形成。这
17、似乎至少在一定程度上取决于哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）/Akt途径，已知该途径可调节自噬。值得注意的是，两种血小板衍生的外泌体微小RNA,miR-15b-5p和miR-378a-3p,显示出抑制抗吞噬细胞mTOR/Akt信号传导，从而增强NET的形成。3、NETS激活血小板并促进凝血血栓形成的生理学通常由Virchow三联征来解释，该三联征包括三类：血流停滞、血管壁损伤和高凝状态。通常，出现上述三个参数中的一个就可能导致血栓形成。令人惊讶的是，NETS可以作为血栓形成的支架，在炎症和血栓形成之间提供实质性的联系。事实上，血小板粘附在NETs上从而被激活。这仍然留下了一个问题,NETS的哪一
18、部分实际上触发了这种血小板反应。完整的NETS在体外通常不能诱导凝血或血小板活化。DNA组织成染色质，中和负电荷，完全消除了DNA触发凝血酶诱导的凝血的能力，这可能解释了为什么同样由染色质纤维组成的完整NETS往往不能做到这一点。另一方面，完整的NETs（含组蛋白）被证明通过凝血因子FXII和FXI的血小板非依赖性激活以及无机聚磷酸盐（polyP）的血小板依赖性释放来触发凝血酶的产生。在用DNase分解NETs后，这一点得到了增强，假定释放了NET-结合的组蛋白和其他蛋白质。血小板衍生的PolyP能够以因子FXn依赖的方式激活凝血的内在途径。有趣的是，在动脉ST段抬高型心肌梗死（STEMI）中
19、，血小板PolyP反过来也通过mT0R抑制和自噬诱导中性粒细胞NETosisepolyP的释放高度依赖于梗死区附近存在的凝血酶，在凝血酶、NETs、血小板和PoIyP之间形成另一条道路，导致血栓形成。最后，NETs的促凝能力作为一个整体仍然是一个有争议的问题，这些研究大多是在体外进行的，在动物模型中发现的病理生理条件可能会提供不同的结果。此外，中性粒细胞衍生的微粒（MP）在小鼠腹部败血症中粘附于NETs,并促进凝血酶的产生。这些MP在体外PMA诱导NETosis后释放，并通过磷脂酰丝氨酸粘附在NETs上的组蛋白上。有趣的是，MP的形成与PAD4驱动的NET形成途径无关，因此必须独立于NET的形
20、成而发生，尽管可以通过PMA诱导。此外，这些MP具有结合因子XII的能力，并通过凝血的内在途径诱导凝血酶的产生，可能促进（更局部的）血栓形成。NET蛋白组蛋白H3和H4以及组织蛋白酶G在体外触发血小板活化和聚集（图3）。组蛋白H3和H4因此可以通过TLR2和TLR4途径发挥作用。此外，组蛋白（特别是H3和H4）触发血小板中结节样受体蛋白（NLRP）-3炎症小体信号传导和胱天蛋白酶-1裂解的激活，这也可能导致随后的血栓形成。NET和组蛋白刺激血小板也会导致P-选择素表面表达的增加，以及血小板细胞表面的磷脂酰丝氨酸（PtdSer）暴露。这是关于NETS如何触发血小板驱动的凝血的重要线索，因为尤其是
21、质膜上的PtdSer暴露被证明有助于凝血因子在带负电荷的磷脂上的积累，从而促进凝血酶的产生。血小板二磷酸腺昔（ADP）受体P2Y12以及粘附受体GPIIb/IIIa在用NETS刺激后的血小板活化中发挥作用（INETS刺激血小板后，Syk介导的酪氨酸磷酸化增加，导致磷酸化下游Akt和Erk12增加。阻断Sykind诱导的磷酸化导致血小板聚集减少、颗粒密集分泌、P-选择素和GPIIb/IIIa表达活化。此外，NADPHox1被证明负责NET刺激后血小板致密颗粒的分泌。这证明了NETS可以在血小板中刺激的信号通路的广泛多样性。图3.NET激活血小板并驱动凝血3.1VWF将NET的形成和凝结联系起来V
22、WF能够通过其Al结构域结合组蛋白，指向NET形成和凝固之间的另一个界面。除此之外，组胺刺激的内皮细胞释放的VWF纤维显示通过上述A1结构域直接结合DNA和NETs,而不涉及其他蛋白质如组蛋白。在该体外实验中，由于DNA和血小板GPIba之间对VWFA1结构域的竞争，血小板无法与VWF结合。血小板反应蛋白解整合素金属钛酶13(ADAMTS13)通常将形成的VWF血小板串切割成小片段，将其从内皮细胞表面清除，从而降低血栓形成性。此外，ADAMTS13切割VWF已被证明可以减少白细胞向损伤部位的迁移。实验表明，在体外，DNA对VWF的占据通过潜在地改变A2结构域(ADAMTS13的切割位点)周围的
23、电荷，略微降低了ADAMTS13切割能力，但VWF的去除似乎没有受到太大影响。肽基精氨酸脱氨酶4(PAD4)是一种参与组蛋白瓜氨酸化和染色质去凝聚的酶，是NETosis过程中的重要步骤，可促进小鼠的DVT。现在已知PAD4也对ADAMTS13活性产生负面影响。将重组人PAD4注射到野生型小鼠的肠系膜小静脉中导致VWF血小板串的显著增加，并且当用氯化铁同时处理小鼠小静脉时也加速了稳定的血栓形成。显然，PAD4使ADAMTS13瓜氨酸化并失活，这使得该酶无法切割VWF血小板串，这可能是观察到的PAD4促血栓作用的根本原因。3.2NETS诱导组织因子产生并裂解血栓反应蛋白-1组织因子(TF)是凝血的
24、重要引发剂。NETs通过组织蛋白酶G和IL-Ia诱导内皮细胞产生TF,与凝血增加一致。此外，生物活性TF定位于败血症患者中性粒细胞的NETS中。来自健康供体的中性粒细胞在与促炎性TNF-a.IL-Ib和G-CSF同时孵育后，将细胞内TF结合到NETs中，并且在大肠杆菌存在下，中性粒细胞与细胞因子混合物孵育后这一点大大增加。组织因子（TF）是凝血的重要引发剂。NETs通过组织蛋白酶G和IL-Ia诱导内皮细胞产生TF,与凝血增加一致。此外，生物活性TF定位于败血症患者中性粒细胞的NETs中。来自健康供体的中性粒细胞在与促炎性TNF-a、IL-Ib和G-CSF同时孵育后，将细胞内TF结合到NETs中
25、，并且在大肠杆菌存在下，中性粒细胞与细胞因子混合物孵育后这一点大大增加。4血小板-NET相互作用在炎症中的病理生理影响自从开始研究NETS可能对周围组织产生的假定病理生理影响以来,它们表现出很高的损伤潜力。许多编织在NETs中的蛋白质保持活性，不仅可以杀死病原体，还可以伤害旁观者细胞，即使在拆除NETS后也是如此。例如，组蛋白H4对内皮细胞和平滑肌细胞具有毒性，部分通过TLR受体的激活和细胞膜中的孔形成。此外，不仅NET的DNA和蛋白质对环境造成的直接影响，而且NET诱导的凝血也对宿主构成了重大危险。免疫系统触发凝血的能力在文献中表现为免疫血栓形成，是血栓形成的一种生理形式，用于防止病原体传播
26、。重要的是，血小板和NETs已被证明在免疫血栓形成的发展中发挥了合理的作用，例如在败血症期间，以防止细菌传播。然而，血小板-NET相互作用的失调也与多种疾病相关，包括心血管功能障碍、自身免疫性疾病、癌症和感染性疾病，最近在新冠肺炎中得到证实。在下一节中，作者将更详细地阐述这种相互作用的后果e4.1血小板-NET在静脉和动脉血栓形成中的相互作用血小板和中性粒细胞作为炎症细胞，在心血管疾病的发病机制中各自都有明确的贡献。然而，它们在NET形成和血栓形成方面的协同作用具有特殊的科学意义，因为NET已被确定为静脉和动脉血栓的常见成分.4.1.1静脉血栓形成NET和DVT之间的紧密联系已在瓦格纳小组的工
27、作中得到证明。静脉狭窄模型中的小鼠深静脉血栓在血栓富含红细胞的部分含有NETs,与VWF共定位，但在富含血小板的白色部分没有。血小板、中性粒细胞和NETS在血栓内的分布表明，血小板介导的中性粒细胞的募集和激活，随后是NETOSiS和红细胞的募集，与NETS纠缠在一起。事实证明，血小板对于白细胞的进一步募集是必不可少的。此外，血栓结合的FXII和血小板诱导/支持的NET形成中的中性粒细胞导致FXII的激活而凝血。因此，DVT中NET的形成可能不是血栓形成的最初触发因素，但肯定会促进血栓形成，血小板募集并激活中性粒细胞导致NETosis0一项对DVT和肺栓塞引起的人类静脉血栓的研究表明，在血栓形成
28、的组织阶段，有大量的NETs,其特征是免疫细胞浸润到形成的血栓中。NETs与VWF共定位，也位于血小板旁边，表明NETS通过NET结合的VWF进一步募集血小板进入组织血栓。此外，血小板HMGB1被证明可促进小鼠的静脉血栓形成。有趣的是，HMGB1的氧化还原形式似乎对其诱导血栓形成的能力有影响。具体而言，二硫化物HMGB1通过与中性粒细胞RAGE受体结合促进NETosise此外，血小板和以自分泌方式释放的血小板衍生的HMGB1之间存在正反馈回路，可能导致额外的血小板募集到血管壁。4.1.2动脉血栓形成动脉血栓形成通常是由动脉粥样硬化斑块的形成和/或破裂引起的。动脉粥样硬化是一种涉及内皮细胞、单核
29、细胞甚至中性粒细胞的炎症过程。动脉粥样硬化斑块的形成，如果不加以治疗，可能导致血管闭塞和动脉血栓栓塞。斑块或动脉血栓栓塞性血管闭塞的结果分别表现为外周动脉疾病（PAD）、导致心肌梗死的冠状动脉疾病（CAD）和随后发生脑缺血性卒中的颅内动脉粥样硬化疾病。中性粒细胞和NET形成在动脉粥样硬化中的重要性变得更加明显，因为各种研究揭示了动脉血管系统中人类血栓中存在丰富的NETo4.2血小板-NET与免疫性疾病的相互作用4.2.1系统性红斑狼疮目前对血小板-NET相互作用在自身免疫性疾病中的作用和后果知之甚少。系统性红斑狼疮（SLE）是血小板-NET相互作用在自身免疫性疾病中病理生理影响的最佳研究实例之
30、一。SLE的特征是过度产生自我识别抗体，例如抗核抗体（ANA）和抗双链DNA（dsDNA）抗体，这些抗体在疾病进展过程中会引起炎症、血管病或血管炎。SLE患者发生静脉血栓和动脉血栓的风险增加。尽管系统性红斑狼疮中的血栓形成被描述为多因素起源，但有证据表明血小板-NET相互作用对凝血有致病性影响。尤其是抗磷脂抗体（aPL）和aPL综合征的发生是血栓并发症发展的危险因素，即使在原发性aPL综合症期间（没有同时诊断为SLE）也是如此。在原发性aPL综合征中，中性粒细胞易于经皮形成NETe抗02糖蛋白1（抗02-GPI）在中性粒细胞中通过TLR4MyD88MAPK轴直接触发NETosis,这些NETs
31、表达TF并促进凝血酶的产生，可能也刺激血小板。此外，一些aPL,例如抗阳-GPI,被证明在血小板中诱导RAGE激活和HMGB1重新定位。这两种分子都与血小板诱导自噬介导的NET形成有关。循环IgG复合物也可能与血小板结合FcgRIIa连接，并导致SLE患者随后的凝血酶超敏反应。凝血酶刺激的血小板可诱导NETosis与中性粒细胞聚集。狼疮患者的血清因子诱导中性粒细胞发育，DNA损伤反应蛋白1（REDD1）诱导中性粒细胞自噬和NETosis,并且产生的NETS被TF和IL17A修饰，被认为导致凝血和纤维化。4.2.2ANCA相关血管炎ANCA相关血管炎（AAV）是一种系统性自身免疫性疾病，专门影响
32、小血管，因此也称为小血管血管炎。抗中性粒细胞蛋白如MP0和/或蛋白酶3（PR3）的自身抗体是这种疾病的特征。小血管的炎症会影响身体的任何器官，并导致严重的器官损伤。ANCA血管炎的三种亚型已被定义：肉芽肿伴多血管炎（GPA）、显微镜下多血管炎和嗜酸性肉芽肿伴多血管炎（EGPA）AAV患者的中性粒细胞不仅表现出更高的基线NET形成，而且AAV患者血小板通过TLR9依赖的XCL4释放刺激中性粒细胞进行NETosis0此外，NET的形成可能通过触发新的血管炎而导致血栓形成和一般疾病进展，因为自身抗原可能在NET中大量存在。4.2.3I型糖尿病中性粒细胞浸润、NET形成与1型糖尿病的发展之间的关联已在
33、非肥胖糖尿病（NOD）小鼠模型中得到证实。现在，已经提出了血小板-中性粒细胞相互作用与1型糖尿病之间的联系。循环中血小板-中性粒细胞聚集体的增加与NCID小鼠胰腺中的NET标记物相关，这表明血小板可能激活中性粒细胞迁移到胰岛，随后发生NETosis和胰岛破坏。尽管在小鼠NOD胰岛中，NETs的形成不如激活的中性粒细胞（MPc+和H3cit+）的迹象那么容易被检测到，但组织和NETS能够在体外分别损伤小鼠和人的细胞以及胰腺。这表明了在活体内观察到的进展中的胰岛破坏和血小板活化的中性粒细胞之间的联系，尽管在活体内NET诱导的胰岛损伤的相关性肯定需要进一步的研究。4.3肿瘤相关免疫血栓形成长期以来，
34、人们一直认为癌症的发展伴随着血栓形成风险的增加。在许多被诊断为癌症的患者中观察到高凝状态。其原因尚不完全清楚，可分为患者相关、治疗相关和癌症相关。例如，肿瘤介导的促凝血因子的分泌如TF被证明与癌症诱导的血栓形成有关。然而，恶性肿瘤也可能通过激活血小板和/或中性粒细胞并伴随NET形成来减少免疫血栓形成。4.3.1肿瘤细胞激活血小板已证明肿瘤细胞激活了血小板，不同类型的癌症的潜在过程不同。许多肿瘤，例如胰腺癌，都能分泌凝血酶，这是一种有效的血小板激活剂。此外，COX-2在癌症中的表达可能导致TXA2的下游合成，这不仅导致炎症进展，还导致血小板活化和聚集。卵巢癌细胞分泌ADP,ADP可以与血小板上的
35、P2Y1和P2Y12结合，从而形成正反馈回路，血小板从致密粒释放更多ADPe结直肠癌细胞分泌促凝血因子，并作为微粒体（MP）内循环肿瘤细胞的一部分。TF通过作用于外源性凝血级联反应启动血管内凝血，特异性作用于因子FVIIa,还间接缓解血小板活化时的血栓生成和纤维蛋白沉积。肿瘤MP由于PtdSer在膜的外小叶上的存在而提供促凝表面。足蛋白表达的癌症细胞可以与血小板CLEC-2相互作用，从而导致血小板活化。因此，血小板轴可能是促进血栓形成的直接途径，或者肿瘤可能直接通过血小板介导的NET形成。文献中有证据表明，血小板和NET与癌症的免疫血栓形成密切相关。例如，胰腺癌细胞可以诱导NETosis,并且
36、在用胰腺癌细胞引发血小板后，这种情况进一步增加，这表明活化的血小板在与肿瘤细胞接触后，可能会传播NET的形成。血小板介导的NET形成与高级别神经胶质瘤患者VTE的发展有关，并且这至少部分依赖于P-选择素和PSGL-1的相互作用。NET介导的PtdSer在血小板和内皮细胞上的表达,以及TF表达、TAT复合物和纤维蛋白形成的增加，可能是VTE发展风险升高的原因。结直肠癌患者之前也有类似的结果，血小板HMGB1是NET形成的主要因素。4.3.2肿瘤细胞诱导NETs形成恶性肿瘤促进免疫血栓形成的另一种方法是诱导NETS形成，进而激活血小板。NET的存在和NET的形成是在各种癌症的背景下证明的。但是，癌
37、症究竟是如何诱发NETosis的呢？推测的答案主要可以通过仔细观察肿瘤衍生的分泌囊泡和趋化因子来找到。经G-CSF预刺激后，注射4T1乳腺癌细胞的雌性小鼠癌细胞源性外泌体可在中性粒细胞中诱导NETse此外，这些动物的循环中性粒细胞数量更高，同时基线血浆DNA和MPO增加，两者都与NETosis有关。肿瘤衍生的G-CSF和IL-8也可能参与激活中性粒细胞,使其在癌症中发生NETosis0事实上，在与产生各种肌细胞因子的癌细胞系的上清液共孵育时，在富营养化中阻断CXCR1或CXCR2消除了NET的形成，这表明CXCR1和CXCR2配体参与了肿瘤介导的NET的形成。其他机会分泌的促炎趋化因子和胞质分
38、裂因子可能促进NET的形成，但这一点仍有待阐明。NETs反过来在癌症患者中诱导高凝状态，如神经胶质瘤患者所证明的那样，这可能导致血栓事件，如VTE或动脉微血栓形成。此外，Gugliettaet等人在小肠肿瘤动物模型中提供了NETs和血小板之间的联系。在这里，小鼠患有凝血的慢性过度激活和血小板消耗增加，这很可能是补体因子C3a激活中性粒细胞产生NETs的结果。根据动物模型，患有小肠癌的人通常会出现高凝状态和中性粒细胞增多症。事实上,癌症患者高凝状态的发现者阿曼德特鲁索（ArmandeTrousseau）在经历静脉血栓形成和其他疾病症状后，诊断自己患有癌症。但是，肿瘤诱导的NET形成和假定的随后血
39、栓形成的（病理）生理后果是什么？通常，肿瘤本身似乎得益于激活血小板或中性粒细胞，分别导致血栓形成或NETse肿瘤环境中中性粒细胞的出现，尤其是NETs的出现，似乎与疾病进展和更差的临床结局有关。此外，CTC利用这一机制保护自己免受免疫系统的影响，或者仅仅作为转移形成的平衡枢纽。CoolsLartigue及其同事证明，在CLP诱导的微血管NET形成后循环肺癌细胞形成肝转移的机会增加，当DNaSe或嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂抑制NET形成时，这种情况就会加剧。有趣的是，小鼠小肠癌中NETS和血小板之间的相互作用直接影响肿瘤的发展，因为用低分子肝素（LMWH）阻断凝血或阻断C3a-R信号减少了肿瘤
40、的形成。因此，了解血小板和中性粒细胞/NET在癌症中的相互作用似乎对找到合适的治疗方法至关重要。综上所述，除了癌症治疗外，靶向癌症中的血小板或NET形成可能会对疾病进展和转移形成产生全面有益的影响。4.4NETs和血小板在C0VID-19患者免疫血栓形成中的假定作用严重急性呼吸综合征冠状病毒-2（SARS-CoV-2）是2019年冠状病毒（新冠肺炎）大流行的病原体。该病毒通过气溶胶传播，并通过气道上皮感染宿主。严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型刺突蛋白与肺上皮细胞膜顶端表达的血管紧张素转换酶2受体结合，从而进入上皮细胞。感染严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型会导致强烈的免疫反应，通常会对宿主造
41、成严重后果，如肺炎的发展。在更严重的病例中，感染可能会导致急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和多器官衰竭，迫切需要进入重症监护室（ICU）并在ICU进行治疗“严重新冠肺炎患者的中性粒细胞-淋巴循环增高，并伴有高凝状态。较高的中性粒细胞与淋巴细胞比值通常预示着患者在多种疾病背景下预后较差，包括新冠肺炎。中性粒细胞在SARS-CoV-2病毒进入和感染后被吸收到肺部，中性粒细胞增多是新冠肺炎患者的常见症状。肺炎、急性呼吸系统综合征和多器官衰竭的后续发展可能是严重患者严重富营养化效应功能的直接结果，尤其是NET的形成。此外，在感染的ICU甚至非ICU患者中观察到细胞因子水平异常升高。与健康对照组相比，患者
42、血浆中IL-Ib、IL-6、IL-7、IL-8、G-CSF、GM-CSF、IFNg、PDGF和TNFain的水平可能更高。具体而言，IL-Ib、IL-8,TNFa和G-CSF在文献中被定义为NETS诱导剂，这些细胞因子的更高水平，特别是联合使用，可能更容易刺激嗜中性粒细胞形成NETso事实上，新冠肺炎患者的血浆MPO-DNA复合物、无细胞DNA和H3cit水平升高，所有这些都表明NET形成。新冠肺炎患者的血清诱导健康人中性粒细胞形成NET,进一步证明趋化因子和细胞因子可能参与NET的形成。此外，从新冠肺炎患者中提取的血中性粒细胞经常被发现已内化SARS-CoV-2,并且形成NETs的能力增加可
43、能是严重急性呼吸系统冠状病毒2通过尚未确定的机制感染中性粒细胞。或者，更可能的是，中性粒细胞作为吞噬细胞清除病毒和凋亡体，从而被动地吸收病毒颗粒。这究竟是如何导致中性粒细胞中NET的形成仍有待阐明。例如，对于其他病毒，已经证明中性粒细胞模式识别受体是重要的不敏感病毒成分，同时可能是NETosis途径的转导者，这在严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型的情况下也可能成立。迄今为止，尚不清楚新冠肺炎的NET形成是否先于血小板活化，或者血小板是否导致免疫血栓形成和随后的并发症。可能是中性粒细胞首先通过形成NETS发挥作用，并引发随后的级联反应。观察到的中性粒细胞增多症，以及NET标记物与凝血病之间的相关
44、性支持了这一框架。然而，血小板也可以被病毒和免疫系统的其他成分激活。最后，可以肯定的是，这两个级联至少可以相互支持，因为中性粒细胞和血小板都是肺组织中的敏感细胞，因此可能与病毒颗粒、危险相关分子模式（DAMP）和细胞因子风暴接触，根据Fajgenbaum等人提出的定义。在新冠肺炎患者中表现为循环细胞因子水平升高和急性全身炎症症状，继发性器官功能障碍是由炎症引起的，超出了对病毒的异常反应。鉴于NETS会对旁观者组织和细胞造成重大损伤，包括血栓形成前的潜力，失调的NET形成很可能会增加ARDS、肺损伤和凝血障碍的发展。最后，究竟是什么首先导致了NET形成的增加，目前仍不清楚，但可以肯定的是，病毒浸
45、润本身、大规模细胞因子风暴、暴露于PtdSer的EVS释放、自身抗体和活化的血小板都是造成这一现象的原因。另一个环可能是通过NET成分（如组蛋白和组织蛋白酶G）激活血小板而形成的，进一步传播凝血和免疫血栓形成（图4）。简言之，一旦失去控制，这种破坏途径可能会发展为破坏的真实循环，从而驱动新冠肺炎的病理变化。图4.血小板-中性粒细胞相互作用的恶性循环导致C0VID-19中的免疫血栓形成5血小板-NET相互作用对免疫血栓形成的影响从进化的角度考虑NET的形成，NETs在体内的溶解是由内源性DNA酶执行的，保护宿主免受长期损伤。因此，从理论上讲，NET相关病理机制的逻辑后果应该是给予重组DNA酶，这
46、在许多疾病模型中都已经做到了。同样，针对免疫血栓形成的NETS也必须破坏炎症和血栓形成之间的联系。事实上，这种前瞻性的解决方案可能并不像预期的那么简单，因为忽视复杂生物系统中复杂的潜在病理生理途径可能是危险的，并且提供的问题比保护宿主更多。因此，定位跨越炎症和血栓的桥梁并确定关键参与者被认为是血小板-NET相互作用介导的疾病发作和进展的靶向治疗的前提条件。为此，动物模型被证明是深入了解疾病依赖性血小板-NET相互作用的有用工具。靶向NETs和NET结合蛋白在静脉和动脉血栓形成的动物模型中具有全面有益的作用。DNase输注可保护小鼠免受IVC狭窄后的血栓形成。相应地，来自脑动脉闭塞实验模型的小鼠
47、对重组人DNaseI靶向NETS反应阳性，以减轻疾病负担。虽然人类体内的DNaSe可能是急性事件的有趣靶点，但它目前不是长期预防性治疗的选择，因为针对系统性DNase的抗体产生限制了其使用。已经在靶向PAD4以通过消除组织瓜氨酸来抑制NEToSiS方面进行了进一步的成功尝试。静脉血栓形成小鼠模型中的PAD4不仅可能是-个有趣的靶点，因为NET的预防，而且可能是因为ADAMTS13抑制的假定效应。此外，小鼠中PAD4的缺乏确实会影响NET的形成，但不会影响内皮细胞或血小板的功能，这使得它对不必要的脱靶效应更具吸引力。在类似的方法中，抗瓜氨酸组蛋白（tACPA）的抗体可以成功应用于不同的动物模型，
48、以限制全身炎症，例如类风湿性关节炎、炎症性肠病或癫痫的模型。成功确定治疗靶点和药物后的下一步是将动物模型转化为人类并设计临床研究。然而，到目前为止，在任何血小板-NET驱动的病理机制方面几乎没有取得任何转化进展。尽管NETS本身已被确定为公认的治疗靶点，但针对NETs和人类NETs形成机制的研究似乎少之又少。目前，clinicaltrials.gov上列出了一项成功完成的抑制NET形成的研究。COPD患者接受了达尼里辛治疗，达尼里辛是一种防止中性粒细胞活化的CXCR2拮抗剂，但在达尼里辛处理后，痰中的NETosis没有减少。目前正在进行的一项研究旨在探讨通过血浆置换从脓毒症/败血症相关急性肾损
49、伤患者血浆中去除NETs的益处(NCT04749238)这项研究的结果可能对未来脓毒症患者的治疗具有特别的意义。2018年，一项联合利妥昔单抗(靶向B细胞)对16名系统性红斑狼疮患者进行的开放标签研究发表了关于NET形成的总体有益结果，可能是免疫复合物形成的抑制最初引发了NETosis0Kaiser等人在最近的一篇综述中总结了-些针对血小板-中性粒细胞与抗P-选择素或PSGL-1抗体相互作用的研究。防止血小板-中性粒细胞结合的形成可能是血小板介导的NET形成的一种有趣的方法，在其他疾病的背景下也是如此。总之，这种整体缺乏转化进展的原因可能是由于不同情况下复杂且尚未完全解码的网络，因此是不可预见的脱靶/副作用，随着该领域的更多研究工作，这一点在未来可能会得到改善。6总结尽管在理解血小板驱动的NET形成以及NET介导的血小板活化和凝血方面已经做出了努力和取得了
