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1、ICS 11.080.01CCS C47OB中华人民共和国家标准GB/T18281.120XX/ISO11138-1:2017代替GB18281.12015医疗保健产品灭菌生物指示物第1部分:通则Sterilizationofhealthcareproducts一Biologicalindicators一Part1:Generalrequirements（ISO11138-1:2017,IDT）（送审稿）（本草案完成时间：2023年11月16日）XXXX -XX -XX 发布XXXX-XX-XX实施国家市场监督管理总局Il家标准化管理委员会目次前言II引言IV1范围12规范性引用文件13术语和
2、定义14生产通用要求35生产具体要求56菌量和抗力的测定67培养条件8附录A（规范性）活菌数的测定9附录B（规范性）用经过灭菌处理的载体和初级包装材料测定生长抑制10附录C（规范性）存活曲线方法测定。值12附录D（规范性）部分阴性分析法测定D值15附录E（规范性）存活与杀灭反应特征28附录F（规范性）生物指示物组成部分的关系29,1z.*刖百本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件是GB/T18281医疗保健产品灭菌生物指示物标准的第1部分。GB/T18281已经发布了以下部分：第1部分：通则； 第2部分：环氯乙烷灭菌用生物指示物；
3、 第3部分：湿热灭菌用生物指示物； 第4部分：干热灭菌用生物指示物； 第5部分：低温蒸汽甲醛灭菌用生物指示物； 第7部分：选择、使用和结果判断指南； 第8部分：缩短生物指示物培养时间的确认方法。本文件代替GB18281.12015医疗保健产品灭菌生物指示物第1部分：通则，与GB18281.1一2015相比，主要技术变化如下：删除“尸Wo值”和“包装系统”的术语和定义（第3章，见2015版的第3章）； 增加了一般制造要求，包括表1的修订，例如：可追溯性（见4.3.1）； 更改了载体、初级和次级包装的要求（5.2,见2015版的5.2）；更改了一般抗力要求（6.1.2和6.4.3,见2015版的6
4、.1.2和6.4.3）； 增加了软件确认和检测系统的要求（7.4和7.5,见2015版的7.4和7.5）； 增加了试样样本的数量和要求（附录B,见2015版的附录B）； 更改了标准参考文献和参考书目（参考文献，见2015版的参考文献）； 删除了适用的注释内容（见1.1和7.3.2）。本文件等同采用ISOllI384:2017医疗保健产品灭菌生物指示物第1部分：通则，与本文件规范性引用的国际文件有一致性对应关系的我国文件如下：-GB/T19974医疗保健产品灭菌灭菌因子特性及医疗器械灭菌过程的开发、确认和常规控制的通用要求（ISO14937,IDT）；GB18278.1-2015医疗保健产品灭菌
5、湿热第1部分：医疗器械灭菌过程的开发、确认和常规控制要求（ISOI7665J:2006,IDT）；GB18279.1-2015医疗保健产品灭菌环氧乙烷第1部分：医疗器械灭菌过程的开发、确认和常规控制要求（18011135-1:2007,IDT）；-GB/T19973.1-2015医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分：产品上微生物总数的测定（ISO11737-1:2006,IDT）； GB/T246282009医疗保健产品灭菌生物与化学指示物测试设备（ISoI8472:2006,IDT）o本文件做了下列编辑性修改： 按照GB/T1.1-2020的要求进行了修改，以适应我国的国情； 删除了国际标准的
6、前言，以适应我国的国情； 删除了1范围的注，以避免产生理解偏差； 对术语3.9标定微生物总数的定义进行了修改，以便明确其含义：一一删除了4.1.3最终产品要求中的注2,以避免产生理解偏差；删除了7.3.2注2,以避免产生理解偏差。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由国家药品监督管理局提出。本文件由全国消毒技术与设备标准化技术委员会(SAC/TC200)归口。本文件主要起草单位：本文件主要起草人：本文件所代替标准的历次版本发布情况为：2000年首次发布为GB18281.12000；2015年第一次修订为GB18281.12015；本次为第二次修订
7、。GB/T18281医疗保健产品灭菌生物指示物是有关生物指示物的通用性和专用性标准。GB/T18281旨在提供生物指示物的要求、选择和使用指南以及缩短培养时间的方法，拟由八个部分构成。 第1部分：通则。目的在于提供生物指示物的通用要求。 第2部分：环氧乙烷灭菌用生物指示物。目的在于提供环氧乙烷灭菌用生物指示物的专用要求。 第3部分：湿热灭菌用生物指示物。目的在于提供湿热灭菌用生物指示物的专用要求。 第4部分：干热灭菌用生物指示物。目的在于提供干热灭菌用生物指示物的专用要求。 第5部分：低温蒸汽甲醛灭菌用生物指示物。目的在于提供低温蒸汽甲醛灭菌用生物指示物的专用要求。一第6部分：过氧化氢灭菌用生
8、物指示物。目的在于提供过氧化氢灭菌用生物指示物的专用要求。 第7部分：选择、使用和结果判断指南。目的在于提供生物指示物的正确选择和使用的指南。 第8部分：缩短生物指示物培养时间的确认方法。目的在于提供缩短生物指示物培养时间的确认方法。本文件规定了用于灭菌监测的生物指示物（包括染菌载体和菌悬液）在生产、标签、检测方法和性能等方面的通用要求。对用于不同灭菌过程的生物指示物的具体要求。附录F中介绍了生物指示物的详细图解和组成部分，其中包含GB18281中的两类生物指示物，这表明染菌载体可不用包装，也可以用灭菌物质可穿透的初级包装，暴露于灭菌因子中。抗力特性取决于试验微生物的种类、数量、准备方式、染菌
9、载体基质、染菌、干燥的环境条件以及初级包装的影响。关于生物指示物的选择使用以及结果的指南参考ISO14161o对于任何一个（包括GB/T18281的其他部分所描述的）灭菌过程，生物指示物的抗力也取决于测试时的微生物环境。理论上，这可能导致生物指示物的准备过程中产生很多不确定因素。此外，灭菌过程中可能会出现各种情况，这就要保证产品在各种条件下能充分暴露。因此，当暴露在特定灭菌过程各种条件下时，规范生产的生物指示物的抗力性能表现为D值和相关的Z值。这些值在GBZT18281的其他部分中都有所规定。专业制造商、使用者和权威管理部门都参与了GB/T18281的第1部分至第5部分的起草，其代表了当今科技
10、的发展水平。在GB/T18281的其他部分中所未涉及的具体灭菌过程的生物指示物也要遵循GB/T18281的通用要求，包括抗力性能的测试。这类指示物不能准确定义，可能用于新的灭菌过程，也可用单独的微生物负载来代表。如果这些生物指示物含有世界卫生组织评估风险一组以外的微生物，应满足合适的保藏方法和安全级。GB/T18281规定了确认要求和灭菌过程的控制。医疗保健产品灭菌生物指示物第1部分:通则1范围本文件规定了拟用于确认和监测灭菌周期的生物指示物(包括染菌载体，试验菌悬液)及其他组成部分在生产、标识、检测方法和性能方面的通用要求。本文件的基本要求适用于GBZTI8281的所有部分,对于用于特殊灭菌
11、过程中的生物指示物的要求在GB/T18281的相关部分均有所规定，本文件适用于没有特殊要求的生物指示物。本文件不适用于依靠物理方式去除微生物的检测体系,例如过滤过程或利用清洗消毒器或流通蒸汽等物理和/或机械方法去除微生物的过程，然而，本文件应包含相应的微生物测试系统的内容。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。ISO11135医疗保健产品灭菌环氧乙烷医疗器械灭菌过程的开发确认和常规控制的要求(Sterilizationofhealth
12、careproducts-EthyleneOxide-Requirementsforthedevelopment,validationandroutinecontrolofasterilizationprocessformedicaldevices)注：GB18279医疗保健产品灭菌环氯乙烷医疗器械灭菌过程的开发确认和常规控制的要求(ISOIII35,MOD)ISO11737-1:2006医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分:产品上微生物群的测定(Sterilizationofmedicaldevices-MicrobiologicalmethodsPart1:Determinationofap
13、opulationofmicroorganismsonproducts)注：GB/T19973.1-2015医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分:产品上微生物群的测定(ISOll737-1：2006,IDT)ISO14937医疗保健产品灭菌灭菌因子特性及医疗器械灭菌过程的开发、确认和常规控制的通用要求(SterilizationofhealthcareproductsGeneralrequirementsforcharacterizationofasterilizingagentandtheDevelopment,validationandroutinecontrolofasterilizati
14、onprocessformedicaldevices)注：GB/T19974医疗保健产品灭菌灭菌因子特性及医疗器械灭菌过程的开发、确认和常规控制的通用要求(ISO14937,IDT)ISO17665-1医疗保健产品灭菌湿热第1部分：医疗器械灭菌过程的开发、确认和常规控制要求(SterilizationofhealthcareproductsMoistheat一Partl：Requirementsforthedevelopment,validationandroutinecontrolofasterilizationprocessforMedicaldevices)注：GB18278.1医疗保健
15、产品灭菌湿热第I部分：医疗器械灭菌过程的开发、确认和常规控制要求(ISO17665-1,IDT)ISO18472医疗保健产品灭菌生物与化学指示物SlJii&(SterilizationofhealthcareproductsBiologicalandchemicalindicatorsTestequipment)注：GB/T24628医疗保健产品灭菌生物与化学指示物测试设备(ISoI8472,IDT)3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1生物指示物biologicalindicator对规定的灭菌过程有特定的抗力，含有活微生物的测试系统。来源：ISO/TS11139：2006,2.33
16、.2载体carrier可涂覆试验微生物的承载材料。3.3菌落形成单位colonyformingunit（CFLJ）由单个或多个细胞生长构成的肉眼可见的活的微生物群落。3.4菌种保藏编号culturecollectionnumber由科学界公认的菌种保藏机构提供的试验微生物的唯编号。3.5培养条件cultureconditions促进微生物复苏、生长和（或）繁殖所采用的生长培养基和培养方式的组合。注：培养方式包括培养温度，培养时间和其他特定培养条件。来源：ISO/TS11139：2006,2.103.6。值DvalueQIO值QIOValUe在规定的条件下，灭活试验微生物数量的90%所需的时间或
17、剂量。注：在规定的条件下，表现出级灭活动力学的其他关键过程变量可以达到90%测试微生物数量的灭活。来源：ISO/TS11139：2006,2.11,有修改3.7灭活inactivation微生物生长和（或）繁殖能力的丧失。来源:ISO/TS11139：2006,2.213.8染菌载体inoculatedcarrier已染上规定数量试验微生物的载体。注：见附录F3.9标定的微生物总数nominalpopulation制造商标定的测试样品上活的微生物数量。注：般以10为底的指数值来表达（如，IO6）3.10初级包装primarypackage包装系统的一部分，用于保持产品的完整性。注：保护染菌载体
18、免受损坏和污染，而不阻碍灭菌因子穿透的系统。3.11过程挑战装置processchallengedevice(PCD)对某一灭菌过程构成特定抗力的装置，用于评价该灭菌过程的性能。来源:ISO/TS11139：2006,2.331. 12抗力仪Fesistometer设计用于灭菌过程中的物理和/或化学变量组合测试的设备。（需修改）来源:ISO18472：2006,3.11,有修改3. 13次级包装secondarypackage供运输和贮存已包装的生物指示物的容器。4. 14自含式生物指示物self-containedbiologicalindicator初级包装中含有试验微生物恢复生长所需培养
19、基的生物指示物。5. 15存活-杀灭区间survival-killwindow在规定的条件下灭菌处理时，生物指示物显示全部生长（存活时间）过渡到全部不生长（杀灭时间）的暴露程度。6. 16存活曲线survivorcurve在规定条件下，随着灭菌因子暴露的增加导致微生物数量被灭活的图示。7. 17菌悬液suspension包含活的试验微生物的液体。注：装在密封好的安瓶瓶内的菌悬液可以作为种生物指示物使用，菌悬液也可以是染菌载体或者生物指示物的中间体。8. 18活菌量viablecount实际可回收的菌落形成单位或其他适合计数方法的计数单位的数量。注：见附录A。9. 19Z值zvalue在热力灭菌
20、过程中，使。值变化十倍所需温度的变化值。注：见ISo11138-3和ISo11138-45,4生产通用要求4.1生产控制4.1.1 质量管理体系应按照本文件覆盖的所有操作要求建立、记录和持续运行一套完整的质量体系（如ISO13485、GMPS或我国其他要求），特别是制造商要在生产的各阶段采取预防措施来使可能对生物指示物性能产生不利影响的污染降到最低。4.1.2 可追溯性4.1.2.1应保持制造的组成成分的可追溯性。4. 1.2.2制造的组成成分应包括掺入或直接接触试验菌悬液、染菌载体和/或其初级包装的所有材料。4.1.3 最终产品要求最终产品应符合以下要求：a）标签（4.3）；b）生产（第5章
21、）；c）抗力特性（6.4）；d）储存和运输（4.4）；e）培养（7.3）o注1：生物指示物的使用方法见ISO14161。4. 1.4人员本文件中的步骤和方法应由经过适当培训和有经验的实验室人员来执行（见ISO13485）。4.2试验微生物4. 2.1菌株4. 2.1.1试验微生物应为被确定的菌株，来源于公认的菌种保藏机构，并应通过适当的试验方法进行鉴定。应根据购买者的要求提供可追溯性说明。4. 2.1.2试验微生物应为符合以下条件的菌株：a）试验微生物需用合适的方法来处商要特殊保藏方法.K镭要特殊的操作条件不需要特殊的运输和邮递要求（例如世界卫生组织2004风险评估小组一组要求）；b）按照标签
22、指示进行运输和储存，在标称的保质期内保持充分稳定以维持菌株的抗力特性。注：般来说，生物指示物使用的试验微生物来自细菌芽电，通常是源自芽把杆菌或芽抱杆菌属C4. 2.1.3除细菌芽预外，试验微生物也可以是被证明对灭菌过程有合适抗力的微生物。4. 2.2菌悬液的初始接种物10. 2.2.1每批试验微生物悬液的最初接种物应符合以下要求：a）可追溯到公认的菌种保藏机构的标准菌株；b）其种类和纯度已被验证。4.2.2.2指定保存试验微生物菌种的方法应当能保证培养物不受污染，且应将引起其固有的性质发生变化的不利影响减少到最小。4.2.2.3对于每株试验微生物的验证检测应被记录和确认。4.2.3试验微生物数
23、量悬液的试验微生物活菌数应按照附录A的进行确定。4.3制造商提供的信息（标签）4. 3.1每批菌悬液、染菌载体和生物指示物的标签上应有以下信息： 可追溯生产过程的唯一性编号； 试验微生物的名称； 与菌悬液、染菌载体或生物指示物适用的灭菌过程标示； 按照ISO8601规定的方式标明的失效期，例如，XXXX年XX月XX日； 制造商的名称，商标，地址或其他识别方法：国际公认的符号可在适当的地方使用(见4.1.3,ISO15223/和ISOlII401)。4.3.2每批产品的次级包装除4.3.1中提供的信息外，还应包括表1中给出的信息。表1制造商提供的信息信息要求菌悬液染菌载体生物指示物菌悬液的标称容
24、积(mL)必需一一产品适用过程、抗力以及膨响抗力的操作过程和载体2必需必需必需详细的储藏条件必需必需必需处置说明必需必需必需使用说明，尤其是有关灭菌处理后用于恢复试验活菌的培养基和培养条件的数据必需必需必需每亳升试验微生物的数量(菌悬液)或每单位菌含量(染菌教体或生物指示物)&必需必需必需次级包装中产品的数量一必需必镭参考本文件必需必需必需a制造商应根据要求提供用于确定抗力和数量的测试方法4.3.3如使用专用仪器进行生物指示物的生长结果检测，仪器制造商应规定该仪器的用法，并应提供校准证书和关于重新校准程序所需的信息。4.3.4如适用，应提供应提供专用仪器所需的维护保养的信息，包括如何进行维护、
25、保养和保养频率的详细说明。4.4储存和运输4.4.1应遵照试验微生物悬液的储存和运输条件，确保试验微生物悬液符合本文件和ISolII38相关部分的要求。4.4.2若染菌载体为储存和运输而被包装，对染菌载体的包装方式应不影响其标称微生物数量和每个染菌载体的性能。4.4.3应遵照染菌载体的储存和运输条件，确保染菌载体符合本文件以及ISO11138相关部分的要求。4. 4.4单独包装的生物指示物应放进次级包装中运输和储存。用于运输和储存的包装应确保生物指示物符合本文件以及ISO11138相关部分的要求。5生产具体要求5. 1菌悬液5.1.1 培养基和培养条件应能保证稳定地生产出符合本文件和ISO11
26、138相关部分性能要求的试验菌悬液。5.1.2 菌悬液培养基应不影响试验微生物的稳定性，并应与染菌载体和生物指示物生产中使用的工艺和材料相容。5.1.3 采集方法和载体接种过程中的后续处理应确保残留物不对染菌载体和生物指示物的性能产生不良影响。5.2载体、初级和次级包装5. 2.1载体、初级和次级包装的材料应不含有任何对生物指示物的性能产生不良影响的污染物（物理的，化学的或微生物的）。6. 2.2载体，初级和次级包装以及规定的储存条件应被设计保证生物指示物在有效期内性能特性在标称的保质期满足本文件要求。应在购买者要求时提供载体每个维度的最大值和最小值。7. 2.3在灭菌过程中和灭菌后，载体和初
27、级包装应不残留或释放任何物质到培养基中，否则会抑制少量存活试验微生物在培养条件下的生长。应按附录B进行试验，检查是否符合这一要求。8. 2.4载体、初级和次级包装应耐受预期使用的运输和处理，保证无毁坏或破损。5.2.5用于载体和初级包装的原材料应能经受暴露于预期灭菌过程，以保证染菌载体或生物指示物性能指标在预期用途下稳定,应通过观察载体和初级包装暴露于灭菌过程的物理和化学变量极限变化率和变化范围的情况来检验是否符合标准。注：相关的灭菌条件见ISOllI38的其他相关部分。5.3染菌载体5.3.1制造染菌载体的材料应能经受暴露于灭菌过程中不会变形熔化、腐蚀或其他损坏，从而影响染菌载体的使用。5.
28、3.2除非制造商已经证明多个菌种的使用不会严重影响在特殊灭菌过程中试验微生物的性能，否则应采用同一株试验微生物，制备一批染菌载体。5.3.3接种前，应依据ISO17665-1,ISO11135和ISO14937或其他的相关灭菌方法，对载体进行灭菌，如果灭菌不可行，接种前可依据ISO11737-1：2006建立可接受的生物负载限度要求（见附录B）。5. 3.4载体的接种应保持一致的微生物数量（见6.3）。5.4 生物指示物5 .4.1应把单个载体分别装入初级包装内作为生物指示物。6 .4.2预期适用的初级包装应被确认（见附录B）。5.5 自含式生物指示物自含式生物指示物的性能应经过确认，其中包括
29、培养基对经过灭菌过程后试验微生物的恢复能力。6菌量和抗力的确定6.1 抗力的通用要求6.1.1 每批次/批量生物指示物的抗力应经过检测，以证明符合本文件及ISOHI38其他相关部分的性能要求。6.1.2 灭菌过程中生物指示物的抗力特性在ISOllI38的其他部分中没有规定时，应按照己经描述灭菌过程的试验条款确定（见ISoI4937）。6.1.3 二般认为亡程的的确认和监视瞰用丕穗足ISOll38规定的最低菌量和或抗力标能够提供以下信息的生物指示物是可以被接受的：a）符合ISO11138所有其他要求（包括数量和抗力的试验方法）；b）产品信息中，包括对菌量和抗力的明确声明，和c）当菌量和/或抗力（
30、若适用）低于IScH于38的相关部分的规定值时，产品标签要有明确警示。6.1.4 抗力试验应包括活菌量而抗为特性的确见63和6.4）o6.2 试验微生物应规定试验微生物（见4.2）。6.3 试验微生物的数量6.3.1应确定活菌量（见附录A）o6.3.2当结果介于制造商标称数量的5O%3OO%之间时，菌量验证应被视为通过。在有效期内，最终用户或制造商检测出活菌的数量，可能介于制造商标定值的5O%3OO%之间，但也可能低于本文件中定义的最小菌量。在这些情况下，原始种群如果确认检测结果在50%300%之间，则被认为是验证通过的。6.4 抗力特性6. 4.1抗力特性应通过以下方法的组的确力：a）通过建
31、立存活曲线酶。值（见附录C）；b）通过部分阴性法脸。值（见附录D）；c）验证存活杀灭反应特性（见附录E）。7. 4.2由这些方法获得的数值应在ISoll138其他部分规定的范围之内，生物指示物标签上至少标有n三（见4.3）o8. 4.3在有效期内，利用制造商给出的检测方法，D值应在制造商标称值的20%之内。理想状态下，存活曲线在整个灭活区间呈线性关系。实际上，有偏离的情况发生，但是线性应保持在可接受范围之内。通过计数法建立的抗力曲线存活菌数量大于5x101而基于统计计算的部分阴性分析法建立的抗力曲线存活菌数量低于5xl0,通过两种方法获得的。值有良好的相关性，与线性存活曲线无严重偏差。ISO1
32、1138的相关部分可增加其他的要求例如用于湿热灭菌（ISo11138-3）或者干热灭菌（ISO11138-4）的生物指示物的Z值。本文件和ISo11138的其他部分规定的抗力特性应声明具体的测试条件。在有效期内，制造商或终端用户利用制造商给出的方法检测出的。值范围在20%之内。但可能会低于本文件中定义的小。回，在这些情况下，原始的。值如果确认试验结果在20%之内范围内，则认为是被核实的。9. 4.4当存活曲线图由全部存活试验微生物数量的Iogio值对时间半对数作图时，所得曲线的线性相关系数r2应不小于0.8（见附录C）o6.5 试验条件抗力特性和菌量的测定应在指定的试验条件下进行，见表2：表2
33、试验所需要的最少样本ISO11138-1的测试方法检测样品的最少是最小暴露数量检测样品的最小总量测试活菌的初始数量a4一4附录C存活曲线方法4520附录D部分阴性法205b100b附录E存活杀灭区间502100最小总数应取决于方法组合的选择124或204a未经过灭消的染菌载体和生物指示物的活菌数。bt6（见表D.1）之后的暴露条件下的额外检测不用于计算，但却是作为评判结果有效与否的条件。注：对于特殊灭菌过程的一般性检测方法在ISolU38的相关部分有所解释。7培养条件7.1 培养箱7.1.1 培养箱应能设置，监测与证实具体的培养条件。7.1.2 除常规的温度监测外，培养箱内的温度分布应被确认。
34、7.2 生长培养基7.2.1生长培养基应被规定和证明，可以支持V100个试验微生物接种物的生长。7.2.2标签上应包括暴露于灭菌过程后培养条件的信息（见4.3）,7.2.3生长培养基应被确认，以确保它可以中和任何可能影响试验微生物活性的残留灭菌因子（见5.2.3）。7.3培养7.3.1应确认培养温度和时间。1.1 3.2制造商应提供培养指南（见表1）O对于一个公认的灭菌过程例如湿热灭菌和环氧乙烷灭菌，利用合适性能的试验微生物，分别为嗜热脂肪地芽抱杆菌和萎缩芽抱杆菌，其培养时间通常为7天。对于一个新的灭菌方法，7天的培养时间是不充足的，至少应使用14天作为确认的参考培养时间。注：有效的培养时间可
35、能比参考培养时间短。（删除注中标号“1”）7.4 软件确认对于包含软件或医疗软件的培养箱,软件应根据目前的技术水平进行确认，并考虑到开发生命周期,风险管理、验证和确认的原则。7.5 使用检测系统的培养时间如果将特定的检测系统与特定的生物指示物一起使用，则制造商应定义两者的组合，且该组合在确定培养时间时被使用。附录A（规范性）活菌数的测定A.1通用要求A.1.1通过菌落形成单位（CFUS）检测方法统计菌悬液、染菌载体或已包装的生物指示物上的试验活菌。这种方法常用于预期回收菌量在5x10ICFU以上的情况。A.1.2应按照A2A.4规定的方法检查相关产品恢复的试验菌，这种方法适用于处理和未处理的样
36、品，同时也可以用于初始活菌数（未处理的样品）的检测以及利用存活曲线（处理过的样品）检测。值。A.1.3可以使用已证明的与平板计数法等效的其他方法。A.2试验样品的最小检测数量每批量/批次或每次暴露应至少使用4个测试样品。A.3样品的准备和培养方法A.3.1应把检测样品放入一定体积的培养液中，应通过已确认的程序（例如用玻璃珠振荡，研磨和/或用混匀器和/或混合器混匀涡振荡，超声波或其他合适的方法）将试验微生物从试验样品上洗脱下来（JLISO11737-1）OA.3.2若需要，应通过稀释的方法，用合适的无菌稀释液调整微生物在悬液中的浓度。在任何情况下，利用上述方法，使菌落形成单位的数量宜控制在特定范
37、围之内。将培养物与融化的固体琼脂培养基混合或涂布在有固体培养基的平板上，菌落数控制在30CFU300CFU之间最为精确。A.3.3应利用合适的检测方法统计活菌数。合适的方法包括膜过滤法，半固体培养基涂布法，以及固体培养基混合法（见ISc）II737-1）。A.3.4生物指示物制造商应确认或提供合适的试验微生物恢复培养基，和/或准备培养基的全部资料和说明。A.4培养和计数A.4.1平板样本或滤膜应在制造商规定的温度和时间下培养。通常，嗜热菌的培养温度在55C60C下，时间不少于48h；常温菌的培养温度在30C37C下，时间不少于48h。注：在较高的培养温度下，培养基的干燥性会显著影响生长。A.
38、4.2经过适当的时间培养后，应对平板或滤膜上的菌落数进行计数，再计算出每个合适单位上恢复试验微生物的平均数。附录B（规范性）灭菌后载体和初级包装材料生长抑制的确定B. 1通用要求本方法通过确定载体和初级包装材料对灭菌后试验微生物生长可能的抑制效果来测定其在确定灭菌过程中的适用性。这些材料物理性能的适用性应经过测定（见5.2和5.3）,检测方法在ISoIII38的相关部分已给出，抗力仪的相关要求见ISeM8472。B.2材料B.2.1试验菌悬液与染菌载体使用的细菌同株，而且制备方法相同，悬液内细菌总数应可知，可经活菌计数确定，能够分成含有少于100CFU活菌的试样。B.2.2培养箱应能设定特定培
39、养条件的温度，并能监测确认。B.2.3培养基应符合培养条件规定。8. 2.4检测样品应为根据B.3要求准备的染菌载体和初级包装材料。B.3步骤B.3.1准备15管培养基，均平衡至培养条件规定的培养温度。装入体积与通常菌悬液、染菌载体和生物指示物生长培养基的体积相同。B.3.2取具有代表性的18个已灭菌未染菌载体，分成9组，每组2个，应用制造生物指示物的材料进行包装。注：如灭菌不可行，见5.3.3。B.3.3取B.3.2中的6组样品，每组包含2个载体，并将其暴露在灭菌过程中。B.3.4按照ISo11138的其他相关部分要求的数值设定抗力检测仪的合适操作条件。B.3.5灭菌终止时，除去载体的包装，
40、在无菌条件下未经中间处理直接转移到培养基中，在6管平衡至培养温度的培养基中分别加入一组2个载体（见B.3.1）,记录完成转移的时间。B.3.6将包含载体样本的生长培养基在规定的温度下培养2h10min,以便载体上的抑制物解除吸附。将此培养基取出培养箱，每管接种不多于100个活菌的试验微生物悬液，再把此接种细菌的培养基放回培养箱。在正常使用条件下，按确定的恢复生物指示物的时间进行培养。B.3.7将未经暴露过程，包含2个载体的剩余3组转移到3管培养基中作为对照，培养2h10min,在每管接种VloO个试验微生物，在确定时间内按照B.3.6相同的方法培养。B.3.8如果发现无菌载体的使用会影响检测结
41、果，应进行微生物的鉴定。B.3.9生长培养基对照，将3管无载体的生长培养基培养2h10min,在每管接种不少于100个试验微生物，在确定时间内按照B.3.6相同的方法培养。B.3.10其余三个生长培养基的容器用作阴性培养基的对照。培养这些未接种的培养基容器，在正常使用条件下恢复生物指标的有效时间。B.4结果分析B.4.1如果在阳性对照中出现一个或多个“无菌生长”，则本次试验无效。注：阳性对照无菌生长可能是由于接种试验菌总数失控或恢复条件不合适（如生长培养基、培养时间、培养温度等工B.4.2如在载体对照中出现一个或多个“无菌生长”，则表明载体不适合生产染菌载体或者生物指示物。注：在生长培养基的载
42、体对照中出现“无菌生长”，则表明载体材料对试验微生物的生长有抑制。B.4.3若被灭菌过的载体在六次试验中出现一个或者多个“无菌生长”，则表明载体材料不适合生产染菌载体或者生物指示物。注：无菌生长可能是由于处理过程中载体材料上吸附高浓度的灭菌剂或发生降解引起的。B. 4.4如果在阴性对照中出现一个或多个“有菌生长”，则本次试验无效。注：阴性培养基有菌生长，可能表明培养基样品已被污染。B.5初级包装材料生长抑制性的确定B. 5.1初级包装材料应按照类似载体的方法进行试验示例：按照步骤B.1-B.4使用初级包装材料作为检测样品。C. 5.2试验中被测试的初级包装材料与培养基接触的部分，应是正常染菌载
43、体面积的两倍。对自含式生物指示物，则等于正常接触恢复培养基的面积。检测样品应该浸没在生长培养基中。附录C（规范性）存活曲线方法测定。值D. 1通则本方法是通过直接计数菌落数（CFUS）检测存活试验微生物的数量。这个方法也称为直接计数法，见附录A。注：这种方法可行的最低限约为5l0CFUs。C.2材料C.2.1测试样品如芽泡悬液，染菌载体或已包装的生物指示物，应包含在材料当中。该方法要求检测样品的最小值为20。注：检测方法在GBZT18281的其他部分给出，抗力仪的其他规定由ISol8472给出。C.2.2培养箱应能设定特定培养条件的温度，并能监测确认。C.2.3符合培养条件的生长培养基应包含在
44、材料当中。C.3步骤C. 3.1测试样本应暴露于规定的暴露条件。暴露范围应规定，见表2。D. 3.2应至少有5次暴露，而且应包括以下几方面。a）有一次暴露中样本未经灭菌因子处理（例如0暴露时间）；注：灭菌因子可不存在或由惰性气体或介质替代。b）至少有一次暴露使活菌数降低到最初接种量的0.01%（减少41ogo）;c）至少有三次暴露介于a）和b）情况之间。C.3.3每次测定中每次暴露所用的试验样本应不少于4个，每次暴露应采用相同数量的试验样本。C.3.4如果灭菌因子在试验样本上或内部有残留，要尽快去除以免影响测试结果，如果需要，去除程序应被验证。C.3.5每次暴露2h内，应对测试样本进行处理，让
45、试验微生物从载体上脱落，在常用条件下恢复，采用制造商规定的培养条件和方法进行活菌计数（见附录A）。C.3.6应用合适的无菌稀释液调整菌悬液浓度。将培养物与融化的固体琼脂培养基混合或涂布在有固体培养基的平板上，菌落数在30CFU300CFU之间视为有效。C.3.7用所得的全部存活菌数的常用对数值，对时间（min）或剂量作图，用最小二乘法进行回归分析，确定最佳线性拟合曲线。回归分析时不应包括原先细菌数0.5IogK）范围内的存活数据点，计算所得直线斜率的负倒数值，即等于以时间（min）或剂量表示的指定暴露条件下的。值。a）利用公式（C.1）确定最佳线性拟合曲线的斜率：(C.1)n（HG）-G4B）一（nc）-G2）式中：M一最佳线性拟合曲线的斜率；N一一数据点的个数；G=t(log10y)；A=Q):B=(log0y);C=(t2)O计算所需要的数据在表C1给出。表CJ回归分析所需要的样本数据回收菌量a（y）暴露条件（min或其他重要参数）tbIogioyt2t(Iogioy)(Iogioy)2yt=0.0logoyt2=0.0ti(Iogioyi)=0.0(Iogioyi)2yzt2log0y2tz2t2(Iogioyz)(Iogioyz)2y3t3logoy3tj2t3(IOglOy3)(IoglOy3)2y4UIogIoy4U2U(IOgIOyS)(IogIoy)2y5
