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1、ICS 7 040CCSX04QB中华人民共和国轻工行业标准QBfT5806-2023海参及其制品中海参多糖的测定液相色谱-质谱联用法Determinationofsecucumberpohuccharidesinseacucumbersandtheirderivedproducts-Highperformanceliquidchromatography-massspectrometer2023-11-01 实施2023-04-21发布中华人民共和国工业和信息化部发布本文件按同GWrI.I-2O2O标度化工作S用第1部分，标址化文件的姑构和起草*M0的电起草.本文件由中国羟工业联合会提出.本文
2、件由全国食BT,标准化技术委员食(Sacocm)11.本文件主裳起草单位I大途工业大学.大废3ilMI律生物A业科技股份有限公司.北京M仁重大途)/声食品有限公司.鼻子易集团IR份有*公司.大注晓芹食品有限公甸.蓬蒙谭H生费科技。允所大建隼信Ji化检中。科公司,充技术务有公司大建分公M华检舞认MlUfl股份有*公司ir检评价按术育餐公司.|江华大楼有限公司.本文件主要起人】朱宋寅.董秀律,李双双,焦健.KttM.禺喇学、根杏、，阳.网“金刘名奎WflHI.本文件为*次发布.海参及其制品中海参多糖的测定液相色谱-质谱联用法1范BI本文件述了果用液相色-联用法IN定海参及其晶中寿多的方法本文件运用
3、于*(包括力目焉科、#目科、手参曰犹“仅卬枝子!感料的布品*以及以上魅年为原料加工而成的即畲参、干海&斌*，、*参皎.曲号N国中参多(包括岩IfiI和海岩M整化41较华ID献的定2JR范住引用文件F列文件中的内方通过文中的H他性则用而构成本文件。不可少的条款其中注日购的引用文件.仅修日期对应的版本适用于本文件，不在日期的引用文件,其新版本(包括所树的修电单适用于本支件GB/T6682分析实室用水规格和M方法3点遇初定义F列木的利定义IS用于本文件.11痔安teaCUcambtrplyaccluide由*力*破和参岩茶化SflMkirKiflit.类由Ly精聚化而成的质酸化多Mh海参岩福心化酸软
4、骨K是一类E1结构由0flllTAMKtAM黛单元触成、有岩基支的4.惋度不小于99%.5.4 乳内标thCi2HnOi1.CASNoaY27,维度不小于99%.5.5 乙,帔：色纯5.6 乙睛：色谱纯.5.7 缓冲溶液（PH为10）,称取54g氯化铉溶于20OmL水中，转移至IL容量瓶中，再加入350mL氨水（5.1）,用水定容5.8 三氯乙酸（浓度为2.6mHL3移取19.34mL三氟乙酸于100mL容量瓶中，用水稀释并定容5.9三氟乙酸（浓度为1.3mol/L）：移取9.67mL三氟乙酸于100mL容量瓶中，用水稀耗并定容.5.10 PMP甲醇溶液（浓度为0.5mol/L）：称取1.74
5、g的PMP,用20mL甲醉溶解。现用现配。5.11 1%醋酸水溶液：量取ONmL冰醋酸，加入19.8InL水，混匀。5.12 乙酸钺溶液（浓度为20mmolL）:称取1.54g的乙酸铉，用水溶解并稀释至1L使用前，用微孔滋膜过漉5.13 破酸软骨素标准储备液（浓度为1.0mgmL）,称取硫酸软骨素（5.2）IOmg,用水溶解并定容至10mL.T8保存，有效期24个月.5.14 岩藻糖标准储备液（浓度为LOmgZmLb称取L-岩藻糖标准物顺（5.3）IOmg.用水溶解并定容至IomL-18。C保存，有效期24个月.5.15 混合标准工作液：分别移取适量硫酸软骨素标准储备液（5.13）和岩藻糖标准
6、储备液（5.14）,用水逐级稀释成浓度为100gmL50.0gmLs20.0gg/mL、10.0gmL5.00gmL2.00gmL1.LoOgmL的混合标准工作液.现用现配.5.16 乳糖内标工作液（质量浓度为10gmL）:称取乳糖内标物（5.4）5mg,用水溶解并稀释至500mL.T8oC保存，有效期24个月.5.17 微孔滋膜：水系，0.22m.6仪器和设备6.1 电子天平、感量0.0lg6.2 电子分析天平：感量0.000lg6. 3粉碎机：转速不低于20000rmin46.4 旋涡混匀器：最高转速不低于800r/min。6.5 恒温水浴振荡器：最高振荡速度不低于100rmin6. 6离
7、心机：最高转速不低于4000rmi116.7 恒温干燥箱：温度最大允许误差0.56.8 犯吹仪：气体流It不低于1LZmin6.9 PH计：精度0.1（pH）6.10 高效液相色谱-三重四极杆质谱仪。7测定步骤7.1 试样的制备7.1.1 鲜海叁、即食海参、盐渍海参或海参肠卵的试样制备鲜海参（去擦内脏和沙嘴）、即食海参、盐渍海参或海参肠卵剪成不大于0.5CmX0.5Cm的小块，70C烘干12h,取出后，冷却至室温（25P）,称重，记录含水量，粉碎，用标准目数为10目的筛网过灌，混匀备用.7.1.2 干海参的试样制备干海参粉碎，用标准口头ZHO目的的网7.1.3 胶囊的试样制取胶囊内容物，飕匀片
8、剂的试;片剂研磨粉碎，用标格目数为10目的暗网过滥混匀*用。海参多糖的提取和水:试样中海参多精的提取 a）破解：称取约0.2 g于60 K恒温振到b）醇沉：量取1.00 Oi4 000 r/min 离心 IC c）水解：向常心管市水解E以下步确至（6 h 后.4 UOO dm,上清液于10 mtHl高心管 心IOm唯 ，中，加入4 mL中，加入10.0OmL缓冲溶液（5.7）,匀,4 C静置4 h以I-.,加入1.3 mol/L三氟乙酸（5.9） 0.5 mL,旋涡混匀移至5 mL具有螺试样中海参多糖的;向7.2.1得到中海彩 解筲中的残渣充分溶解， PMP甲醇溶液（5.11）400 甲醉,氟
9、吹除去溶痣以加入,7.2.2得到的混合标准品水解.（推荐量100L）乳糖内桂C水浴加L第水（5.1）,使水除去溶剂.再加入0.5 mL口和胶垫后卵水解管中，以上为1次,共操作3次（以保证高心管中沉淀钙事移至水解管中）密封水解S放入憎温干燥霜中，设定温度105oC水解3h取用水解管T室温（25P）冷却。氯吹除去溶剂，再加入0.5mL甲醇7. 2.2混合标准工作液的水解后取0.50mL混合标售L作液T15JYm!中和胶冷片的燔笞U,胸入2.6molL：筑乙酸（5.8）0.5OmL,刎，放入斛畔5诵中，设定温度10/3h,礴水解怙室温（25P）冷却。氮吹除去溶剂甲醇,氮吹至完全干燥以氟乙明生化7.
10、3.1PMP衍生7.7 .2萃取加入1%醋酸水溶液（IMLOOmL,旋涡混匀，使残渣溶解.再加NImL氯仿旋泯混匀，静H30min,用ImL注射器吸走氧济层Vf层），用氯仿重复萃取3君乙取水层过0.22m微乱流膜，供液相色谱-质谱/质谱检测。衍生后的试样谦布TBr完成疯二否则应冻存（T8。6个月内）。7.8 测定7.8.1 液相色谱参考条件以下液相色谱条件供参考:色谱柱：Ci8,150mm进样量：柱温：30。0，4流动相：假溶液7. 4.2质谱参考条件以下质谱条件佚参考:流速：0.5nImin“人扫描方式正选广扫描:检测方式多重, 雾化气、气帘气. 量以使质,灵敏 谱参数见kL反应监测(MRM
11、)模式;气、碰,气均力J要求，喷雾电厂.斓助热气竭度等应优化人1及其他合适气圈Q前应调节各气体流佳灵敏度，参考质离子源：电啧雾离在同样测试多 对应的相对保留耳 强度百分比表示) 规定的范围，则可件下蕾品中特测物和内标物的保留时间之比，也就是相对 回扁事土2.5对心：且待测物定性离子的相夕 旨浓,，矗近的标准浴液中对应的定性离子的相对，度超#匕W准浴赳对应的定性离沙 中存在对应的待泄物. I用相对 比较,与标准溶液中，最强离子丰度的7偏差不超过表2质潸参数序号目标贴强Z母离子(mz)子离子(*)聚集时间ms碰端Wf去IR电压/V1ITLO150100岩藻糖(Fuc)衍生物495.2373.215
12、04080211150、1002软件素F(CH)衍生物aJ686.3175.06S100187.0150751001504510031/乳糖(Lac)可生物3373.0So100175.0N100_IsZa1507011007.4.3液相色谱颔谱/质造定性;相对离子丰度20% 50%10%般大允许偏差25%50%确证时相对离子丰度的最大7.4.4液相色谱质滑/质谱定量测定根据域样中被测物的含量情况，选取响应值相近的标准工作液起进行色谱分析.标准工作液和特测液中待测物的响应值应在仪潺线性响应范围内。记录色谱峰面积，采用内标法定量。岩藻糖(Fuc)衍生物、软骨素.糖(CH)衍生物和乳精(Lac)衍
13、生物的多反应监测(MRM)色谱图见附录A。8结果计算和衰述试样中岩藻糖残基的含量按公式（1）计算：XJ-XPXI46）PUCm164式中：X2试样中岩藻糖残基的含量，单位为亳克每千克（mgkg），-被测液中岩藻糖的质量浓度，单位为微克每亳升（gmL）；V一样品的定容体积，单位为亳升（mL）,此处取值IOmL：146聚合成多糖后岩藻糖残基的摩尔质量，单位为克每摩尔（gmol）；ZW一试样质量，单位为克（g）:/混合标准工作液的稀择倍数，此处取值2：164岩藻糖的摩尔质量，单位为克每摩尔（gmol）试样中软骨素的含量按公式（2）计算：Xx（100%-19%）mf式中：Xm试样中软件素的含量，单位为
14、充克每千克（mgkg）：po.一被测液中硫酸软骨素的质量浓度，单位为微克每毫升（gmL）；V样品的定容体积，单位为亳升（mL）,此处取值IOmL；m试样版量，单位为克（g）/混合标准工作液的稀释倍数，此处取值2；19%破腰软骨素标准品中硫酸基团的含量I试样中海参多糖含量按公式（3）计算:X = (XFUC + XCH )100%(I-W)X(100% - 27%)(3)式中：X试样中海参多搐的含量，单位为亳克每千克（mgkg）：试样中岩藻糖残基的含量，单位为密克每千克（mg/kg）；Xai-试样中软骨素的含量，单位为毫克每千克（mgkg）W试样的制备步骤中记录的含水量，%。27%一海参多糖中硫
15、酸基团的含量。计算结果以重复性条件F获得的2次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留到整数.9定限本方法中海参多糖的定量限为1000mgkg.10正确度本方法中，试样添加含量为1OOOmgkg30OOOmg/kg时，海参多糖的回收率为95%-105%.11精密度在重复性条件卜获得的2次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%o附录A（参考性）岩藻糖衍生物（Fuc）.软骨素二糖衍生物（CH）和乳精衍生物（LaC）的多反应监泅（MRM）色谱图图A.1、图A.2和图A.3分别给出了岩藻糖衍生物（Fuc）.软骨素二糖衍生物（CH）和乳糖衍生物（Lac）的多反应监测（MRM）色谱图，15t(M母
16、离子495.2T子离f373.2图A,1岩球倚衍生物（FUC）的多反应监测（MRM）色谱图母离子686.3一干离子175.0100CO母禹T6X6.3T了离了187.0AXfi5000强4度3000200010000强GOeO418时间min母寓子686.3子离子492.04.157651011U131415IG时间min图A.2软骨素二糖衍生物（CH）的多反应监测（MRM）色谱图母离子673.3-子离子373.0础3时0。1156010005000犷M1期51强度强度强度母离子673.3-子离子175.0时间Zmin母离子673.3-.子岗子187.0图A.3乳糖衍生物(LaC)的多反应监测(MRM)色谱图
